食品中蛋白质的检测

1、蛋白质的检测简介蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质是由氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。性质具有两性 蛋白质是由-氨基酸通过肽键构成的高分子化合物，在蛋白质分子中存在着氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白质也是两性物质。 可发生水解反应 蛋白质在酸、碱或酶的作用下发生水解反应，经过多肽，最后得到多种-氨基

2、酸。 蛋白质水解时，应找准结构中键的“断裂点”，水解时肽键部分或全部断裂。 溶水具有胶体的性质 有些蛋白质能够溶解在水里（例如鸡蛋白能溶解在水里）形成溶液。 蛋白质的分子直径达到了胶体微粒的大小（109107m）时，所以蛋白质具有胶体的性质。 蛋白质沉淀 原因：加入高浓度的中性盐、加入有机溶剂、加入重金属、加入生物碱或酸类、热变性 少量的盐（如硫酸铵、硫酸钠等）能促进蛋白质的溶解。如果向蛋白质水溶液中加入浓的无机盐溶液，可使蛋白质的溶解度降低，而从溶液中析出，这种作用叫做盐析 这样盐析出的蛋白质仍旧可以溶解在水中，而不影响原来蛋白质的性质，因此盐析是个可逆过程利用这个性质，采用分段盐析方法可以

3、分离提纯蛋白质 蛋白质的变性 在热、酸、碱、重金属盐、紫外线等作作用下，蛋白质会发生性质上的改变而凝结起来这种凝结是不可逆的，不能再使它们恢复成原来的蛋白质蛋白质的这种变化叫做变性蛋白质变性之后，紫外吸收，化学活性以及粘度都会上升，变得容易水解，但溶解度会下降。 蛋白质变性后，就失去了原有的可溶性，也就失去了它们生理上的作用因此蛋白质的变性凝固是个不可逆过程 造成蛋白质变性的原因 物理因素包括：加热、加压、搅拌、振荡、紫外线照射、X射线、超声波等： 化学因素包括：强酸、强碱、重金属盐、三氯乙酸、乙醇、丙酮等。 颜色反应 蛋白质可以跟许多试剂发生颜色反应。 蛋白质在灼烧分解时，可以产生一种烧焦羽

4、毛的特殊气味检测方法目前, 测定食品中蛋白质含量的方法有多种, 一般可分为间接方法和直接方法。间接方法是通过测定样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法; 直接方法则是根据蛋白质的物理和化学性质, 直接测定蛋白质含量的方法。多年来, 利用蛋白质的主要性质( 如含氮量、肽键、折射率等) 和蛋白质含有的特定氨基酸残基( 如芳香基、酸性基、碱性基等) 来测定蛋白质含量的方法不断发展, 主要有凯氏定氮法( 国际经典测定方法) 、分光光度法和滴定法等。1. 凯氏定氮法测定蛋白质最常用的方法是凯氏定氮法, 它是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一, 是被国内外作为法定的标准检验方法。1 材料与方

5、法1.1 试验材料1.1.1 试验样品肉禽制品（牛肉、马肉、荤饺子馅）、豆制品（豆腐乳）、调味品（鸡精）、乳制品（纯牛奶）、糕点（面包）、植物蛋白饮料（椰汁）、冷饮及冰制品（雪糕、冰激淋）。1.1.2 试验药品和试剂所有试剂均为分析纯，水为蒸馏水或同等纯度的水。硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸；40氢氧化钠溶液：称取 40g 氢氧化钠溶于 60ml 蒸馏水中；4硼酸溶液：称取 4g 硼酸溶于蒸馏水中稀释至 100ml；0.1mol/l 盐酸标准滴定溶液；甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/l）与甲基红乙醇溶液（1g/l）按 12 体积比混合。1.1.3 仪器和设备实验室常规仪器及下列各项

6、：凯氏烧瓶：500ml；可调式电炉；蒸汽蒸馏装置；绞肉机：篦孔径不超过 4nm；组织捣碎机；粉碎机；研钵：玻璃或瓷质；化学消化器；凯氏定氮仪；空气滤过器。1.2 试验方法1.2.1 微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法的原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后取消化液的 1/10 加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。包括消化、蒸馏、吸收、滴定 4 个步骤。2.1 微量凯氏定氮法的分析过程2.1.1 样品消化步骤：准确称取一定量的样品，加入硫酸铜

7、 0.5g、硫酸钾10g 和浓硫酸 20ml、玻璃珠数粒小心移入干燥洁净的500ml 凯氏烧瓶中（固体或粉沫用纸卷成纸筒送入），轻轻摇匀，以 45°斜支于有小孔的石棉网上用电炉以小火加热（或先烧瓶放在距电炉较远处），待内容物全部炭化、泡沫停止产生后加大火力（或将烧瓶放在电炉上），保持瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明后继续加热微沸 30min关闭电炉，取下瓶、冷却转移至 100ml 容量瓶中，加水定容。2.1.2 蒸馏与吸收按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至 2/3 容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入 10ml 40g/

8、l 硼酸及2 滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化液 10ml 于反应管内，经漏斗再加入 10ml 氢氧化钠溶液，用少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏 10min，将冷凝管尖端提离液面继续蒸 1min。2.1.3 滴定将接受瓶内的硼酸液用 0.01mol/l 盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。2.1.4 结果计算式中：W蛋白质的质量分数，%；c盐酸标准溶液的浓度，mol/l；V1空白滴定消耗标准液量，ml；V2试剂滴定消耗标准液量，ml；m样品质量，g；0.014氮的毫摩

9、尔质量，g/mmol；F蛋白质系数。2 双缩脲法双缩脲法对白蛋白、红蛋白产生的颜色反应相近, 不受温度影响7, 可快速测定蛋白质含量, 但灵敏度低, 测定范围为120 mg 蛋白质5, 适用于精度要求不高的蛋白质含量的测定, 常用于谷物蛋白质含量测定。三羟甲基氨基甲烷和一些氨基酸、EDTA 等会干扰该反应1 实验方法1.2.1标准样品蛋白溶液的制备以大豆分离蛋白A为标准(凯氏定氮法测得蛋白质含量为84·55% ),用0·05N氢氧化钠溶液制成浓度为10、16mg/mL大豆分离蛋白样品溶液。1·2·2双缩脲试剂的配制称0·375g硫酸铜(CuSO

10、4·5H2O)和1·5g酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O),用125mL蒸馏水溶解,在搅拌下加75mL10% NaOH,用水稀释到250mL,储存于塑料瓶中(或内壁涂有石蜡的瓶中),此时即可长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀出现,则需重新配置。1·2·3标准曲线的绘制取试管,分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL浓度为10mg/mL的大豆分离蛋白样品溶液(相当于含0、2、4、6、8、10mg蛋白质),0.75、0.88、1.0mL浓度为16mg/mL样品蛋白溶液(相当于含12、14、16mg蛋白质),用蒸馏水补足到1mL然后

11、加入4mL双缩脲试剂。用漩涡混合器充分摇匀后,在室温(2025)下放置30min,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取三组测定的平均值,以蛋白质的mg数为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,求回归方程。1·2·4重复性分析及与凯氏定氮法比较取大豆分离蛋白样品B、C、D、E 1g左右,配制样品溶液,用双缩脲法对同一样品蛋白质进行重复测定,比较差异性。对大豆分离蛋白样品F采用凯氏定氮法(GB/T5009·5-1985)和双缩脲法测定其蛋白质含量,每组实验3个重复(n=3),用T检验对结果进行比较,检验其差异性。3.甲醛值滴定法1

12、方法原理牛奶中蛋白质含量与游离氨基酸含量呈良好的正相关。氨基酸为两性电解质,在接近中性的水溶液中,全部解离为双极离子。当甲醛溶液加入后,与中性的游离氨基酸中非解离型氨基反应,生成单羟甲基和二羟甲基诱导体,使氨基酸失去氨基特性,游离的羧基(-COOH)可以用标准碱溶液滴定,根据碱溶液的消耗量得出游离氨基酸含量,乘以经验常数计算出蛋白质的含量。1.2仪器与试剂仪器碱式滴定装置。样品3个品牌的成品纯牛奶和1个企业的鲜原料牛奶。试剂饱和草酸钾溶液:330 g/L;酚酞指示液:5g/L,用乙醇溶液配制;氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=0.1 mol/L;氢氧化钠标准滴定溶液c(NaOH)=0.05 mo

13、l/L;中性甲醛水溶液。1.3测定方法准确吸取奶样10.0 ml于三角瓶中,加入0.5 ml饱和草酸钾溶液和0.5 ml酚酞指示液,约2 min后用0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色。然后加入2 ml中性甲醛溶液,再用0.05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至粉红色,记录滴定消耗的0.05 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的毫升数。1.4结果表述牛奶中蛋白质的含量X(g/100 ml) =C×V1×0·014×6·38×1005·006V×100式中:C氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,单位为mol/L;V1加入中性甲醛溶液后,滴定试样消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,单位为ml;0.0141ml 1 mol/L氢氧化钠标准溶液相当于氮的克数;6.8氮换算为蛋白质的系数;100/5.06经验常数,由本方法实测值与国标法(凯氏定氮)测定值相比较计算得出;V样品的体积,ml成品。计算结果保留三位有效数字。紫外吸收法测定蛋白质含量方法：准确称取已捣碎的猪瘦肉样品109，加入Zmol/LKOH溶液loml，于水浴上煮沸，经一定时间使之完全水解后