猪瘟病毒研究进展

1、猪瘟病毒研究进展摘要：猪瘟（CSF）是一种高度接触传染性致死性疾病，对家猪和野猪都有危害。猪瘟的爆发能够对养猪业造成重大的经济损失。防控和净化该病的主要策略是通过系统的疫苗免疫和免疫稳定后的不免疫净化策略。对于该病防控及净化措施的探索使得学术界和养猪界取得了长足的进步，并且通过不间断的探索，我们对CSFV的复制机制、毒力有了明确的认识，并有助于我们研发相应的疫苗。该综述中，我们对最近在CSFV流行病学、基因组分子结构与特征、病毒毒力的分子机制及抗病毒技术的发展等方面的最新研究成果进行综述。关键词：CSFV、流行病学、反向遗传学、猪瘟病毒生存期、蛋白质功能、病毒毒力1 猪瘟的流行特点和免疫策略猪

2、瘟（CSF、HC）是一种高度接触传染性致死性疾病，对养猪业造成了重大经济损失。该病被OIE陆生动物卫生法典列为必须通报的疾病。该病最早于1810年在美国田纳西州被发现，随后迅速传播至世界各地。该病在加拿大（1963）、美国（1978）、澳大利亚和新西兰等国已被成功净化，但是仍肆虐在亚洲国家、南美、东欧以及部分前苏联国家。该病的病原是猪瘟病毒（CSFV），属于黄病毒科瘟病毒属成员，与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）及边界病毒同属一科。控制CSFV的策略主要包括两个方面，即扑灭措施（不免疫）和系统的免疫净化措施。在采用不免疫策略时，猪瘟疫情的爆发会给高密度养猪区域带来重大经济损失。因此，在除了欧盟之外

3、的许多国家都是用系统的免疫和免疫后净化策略来控制CSFV。例如，中国当前采取的即是免疫净化策略，国家规定养猪区域每年的免疫密度必须达到90%以上。自1904年该病的病原被定性为病毒以后，许多CSFV疫苗被研发。改良活疫苗（通过在非易感宿主体内连续传代得到的减毒活疫苗）被大量使用，其中最主要的毒株是商品化的C株疫苗，该毒株相对其他毒株而言具有安全高效的特点。C株疫苗能够上调抗体水平，并且能够活化T细胞的免疫应答，而基于E2蛋白的亚单位疫苗仅仅能够诱导一种抗CSFV的抗体产生。通过对CSFV毒株的进化分析得知，该病毒分为三种基因型，其中又分为高毒力毒株、中等毒力毒株和低毒力或无毒力毒株（大多数疫苗

4、株）。高毒力毒株和改良的或疫苗毒株都属于基因1型，而基因2型和3型毒株具有较低的毒力。如我们之前报道的一样，基因1型CSFV在田间能够发生多种突变，发生在欧洲和亚洲的基因2型CSFV疫情越来越多。这种现象表明来源于基因1型毒株的E2亚单位疫苗可能不能对基因2型毒株的高毒力CSFV产生有效的保护作用。C株疫苗在很长一段时间内应该都是有效的，得益于它能够诱导T淋巴细胞免疫。GPE毒株疫苗在猪体内传代后毒力有返强现象。C株疫苗的毒力不能通过连续的猪与猪之间的传播试验而返强，但是该毒株能够与田间流行毒株发生基因重组，从而产生新的特性未知的毒株。基于以上的研究结果，对DIVA标记的基因2型疫苗的研制显得

5、特别重要，这有助于我们对CSFV进行控制和净化。该产品的实现依赖于对反向遗传系统的操作和对CSFV蛋白功能的了解。2 反向遗传系统和CSFV毒力研究2.1 反向遗传系统反向遗传学（RG）能够建立一种有着全长病毒基因拷贝的病毒，该方法是现代病毒学研究中一种强有力的手段。RG在探究病毒的复制、感染、病毒蛋白的功能、重组的发生率、病毒与宿主的相互作用、抗病毒研究及标记疫苗研究等方面发挥重要作用。截至目前，已有至少五种拯救CSFV病毒的方法，这些方法从很大程度上促进了CSFV研究的进程。1996年的一项极具重要性的研究报道了一种体外转录系统，研究发现，SK6细胞系在被转染了体外转录得到的RNA后拯救得

6、到了感染性的CSFV。然而，体外转录的RNA的含量很低，随后，四种更好的反向遗传系统被构建，一是Fan等于2009年报道的BHK-21细胞的转染效率是PK15细胞的10倍之多，他们创建了一种新的程序，使用高效转染的细胞（BHK-21）转染体外合成的RNA，利用PK15 IX细胞评价BHK-21细胞（没有CSFV受体）和PK15细胞（有CSFV受体）的转染效率，结果发现，将被感染的PK15细胞的上清作用后，相比于只用体外转录的RNA 转染PK15细胞，能够提高8倍的效率。二是Van Gennip等于1999年研究出的一种新奇的、更加方便高效的体内转录系统，该系统与体外转录系统相比能提高200倍左

7、右的病毒量，他们建立了一种稳定的能表达T7 RNA聚合酶（SK6-T7RNApol）的猪肾细胞系，并且将一种线性化的质粒DNA转染进了SK6-T7RNApol中。三是Bergeron and Perreault于2002年插入了丁型肝炎病毒核糖酶以发挥其催化形成准确的3非编码区的作用。病毒的3非编码区在一种重要的叫做SrfI的酶的帮助下能够规避模板DNA的线性化（Zou et al., 2011）。为了避免线性化，Van Gennip等于1999年利用SK6-T7RNA-pol与环状DNA一起进行体内转录，该操作与体内转录相比提高了20倍的病毒滴度，但是与线性DNA的体内转录相比，病毒滴度降低

8、了近10倍。Huang等2013年使PK-15细胞系稳定表达T7 RNA聚合酶（PK15-T7RNApol），而后利用它进行体内转录。四是Li等于2013年构建的CSFV 的一个5非编码区被CMV启动子、T7启动子和锤头状核酶（HamRZ）标记、3非编码区被HdvRZ、T7终止子和SV40标记的cDNA克隆。HamRZ在被设计的CSFV中能够形成一个精确的5非编码区，并且该cDNA克隆能够被T7 RNA聚合酶或者RNA聚合酶2系统（CMV启动子）所拯救，由CMV启动子在体内转录生成的病毒的量是由T7启动子在体外转录量的120倍左右。一些派生出的cDNA克隆被建立以便进行CSFV的调查研究。重组

9、的能够稳定表达氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因的CSFV病毒能被当做一种对病毒复制和基因表达情况进行定量分析的有效工具。基于这些改变，Qiu的实验室研究出了三种相似的重组cDNAs：一是EGFP-CSFV cDNA，它是由CSFV N蛋白的13和14个氨基酸之间插入EGFP基因后生成的用于一种简单的血清中和试验。然而，对于EGFP的检测需要大量的、昂贵的自动化图像处理设备，并且不能与高效筛选试验（HTS）进行有效的结合。为了解决这一问题，一株能够稳定表达荧光素酶（Fluc）的CSFV N-Fluc 病毒被研制，该病毒中荧光素酶基因被插入到N蛋白基因中以便于进行快速和定量筛选，并能评价CSFV抗病

10、毒药物的效果。另外，一种N蛋白N末端有半胱氨酸短肽标签（TC）（CCPGCC）的cDNA被构建，用于对N蛋白进出核进行可视化的检测。这些可视化的修饰能被用作标记疫苗的候选物，并且有助于我们更进一步地研究CSFV。迄今为止许多具有重大意义的发现都是基于反向遗传系统的，这些发现对于研究CSFV的毒力机制和蛋白的功能建立了较好的基础。这些结果有助于我们开发有效的标记疫苗，尽管CSFV的基因组在发生着突变、重组和其他的一些变化。2.2 CSFV毒力的分子机制我们可以轻易地通过在与病毒的侵入、释放、复制速度、与宿主蛋白相互作用及其他的一些必要的生理过程有关的保守区引进突变获得改变了毒力的CSFV。迄今为

11、止，通过我们对CSFV的cDNA进行反向遗传修饰，发现有7种蛋白（Npro, Core, Erns, E1, E2, P7, NS4B）与病毒的毒力有关。对N蛋白的敲除能够降低病毒的毒力，并且能够诱导SPF猪的免疫反应，该结果提示我们N蛋白在一定程度上与病毒的毒力有关。核心蛋白的四个保守区域（I, II, III和IV）能够与IQGAP蛋白（Rac1和Cdc42的效应器）相互作用，核心蛋白I和 III保守区的插入能够与宿主细胞蛋白IQGAP1相互作用，导致病毒毒力的完全丧失。核心蛋白中的氨基酸替换如K11A, K12A 和 K53A能够扰乱核心蛋白与SUMO-1之间的相互作用，另外，K220A

12、这一替换能够阻止核心蛋白和UBC9之间的联系。所有的这些替换都能够降低CSFV的毒力。另一种致弱CSFV的方法是在Erns蛋白中插入N2A/Q以破坏其糖基化位点，这表明糖基化反应与病毒的毒力有关。迄今为止，所有被分析的瘟病毒属成员包括四个分子内二硫键，它们是由Erns中八个保守的半胱氨酸残基组成。内部的二硫键是由第九个半胱氨酸残基（171Cys）组成，该二硫键能够稳定Erns的二聚体结构并且能够影响病毒的毒力。当Erns蛋白中的30His和79His（79AA定位在Rnase T2家族的保守区）被删除后也能够降低CSFV的毒力，原因是降低了Rnase的活性。高致病性毒株Brescia的E1蛋白

13、C末端被插入19个氨基酸后其毒力能够完全被消除，表明C末端对病毒的毒力维持至关重要。特别地，高毒力毒株BICv在E1蛋白中的N6A、N19A和N100A发生替换后，毒株的繁殖能力和毒力都能被降低。当Brescia毒株的E2蛋白被替换后也能降低该毒株的毒力，表明E2蛋白是CSFV毒力的主要决定蛋白。CSFV E2蛋白中A区域的保守表位140-TAVSPTTLR-148对病毒的毒力起着重要作用。E2基因有一个O-连接的糖基化位点和留个N连接的糖基化位点，所有的这些糖基化位点都与病毒毒力有关，并且对猪体产生保护性抗体和亚单位疫苗的研制具有重要作用。E2蛋白中710位Leu向His的突变只有伴随着Er

14、ns蛋白的一些突变如276R, 476R, 477I才能够减弱病毒的毒力。对E2蛋白C末端多个氨基酸的替换也能够影响CSFV的毒力。P7能够影响CSFV的毒力、复制和感染型病毒的组装。NS4B蛋白中有一个假定的Toll/白介素-1 受体样区域，该区域中有两个保守盒子区域（盒子1：195IYKTYLSIRR204；盒子2：228SVGIAVML235），这些保守区域的突变也能够影响CSFV的毒力。基于这些研究发现，我们推测针对CSFV保守区进行的修饰或改变能够导致该病毒毒力的变化。然而，CSFV的毒力可能还与别的蛋白有关，如Npro, C, Erns, E2, P7和NS4B。3 CSFV病毒复

15、制周期和基因组分子结构3.1 病毒复制周期近几年在CSFV复制周期方面有了大量的研究和结论，当然还有很多环节是不清楚的。一旦CSFV到达宿主体内的靶细胞后，就通过E1和E2糖蛋白介导的粘附和侵入过程开始其感染周期，但是细胞表面受体至今尚未被研究透彻，但是CSFV的受体有可能是CD46，它是BVDV的受体。另外，CSFV的内吞机制也尚未明了（BVDV的侵入依赖于网格蛋白介导的内吞作用）。病毒侵入后，即开始由依赖pH的糖蛋白介导的膜融合，该过程由酸化作用起始，另外，E2蛋白中的短肽129CPIGWTGVIEC139也可能参与了膜融合过程。病毒囊膜与细胞膜融合后，病毒核衣壳被释放到被侵染细胞的细胞质

16、中，此时不依赖于帽子结构的翻译过程导致多聚蛋白的产生并且病毒基因组的复制被启动。CSFV的复制需要负链RNA的合成，它在合成后代RNA的过程中起着模板的作用，研究发现NS5B蛋白能够更有效地与负链RNA的3非编码区结合而不是正链RNA的3非编码区。NS2-3与辅因子NS4A一起介导病毒粒子的形态发生。最终，感染性粒子成熟以后，病毒体从宿主细胞中被释放。所有成熟的蛋白（除了N蛋白）和辅因子N2-3对于猪瘟病毒的复制周期来说是必要的，而NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B对于CSFV RNA的复制来说是必需的。细胞被感染后，细胞内的许多生物过程被调控以加强病毒的复制并在一定程度上

17、介导免疫逃避。这些过程被核蛋白的类泛素化途径调节，在actin和E2蛋白之间相互作用，NS2作用导致S期阻滞，NS5A刺激自噬，N蛋白和Erns调控先天性免疫力。3.2 CSFV基因组和蛋白的结构特征Erns蛋白是一个高度糖基化蛋白质，分子质量的50%大都由碳水化合物构成。Erns以二硫键形成同源二聚体，分子质量大约为97ku， 并且以两种形式存在于宿主细胞中，一种是病毒蛋白，另一种是分泌蛋白。Erns蛋白不仅是一种结构蛋白，而且也是一种多功能性蛋白。它具有神经毒性，抗蠕虫活性以及转导特性， 参与病毒粒子粘附和侵入宿主细胞的过程，并且能够通过介导宿主淋巴细胞的凋亡而使宿主产生免疫抑制导致持续感

18、染。Erns还具有高度特异的RNA酶活性，在其编码序列的活性位点区域中存在有Rh/T2/S RNA酶超家族的同源性序列，在病毒感染早期RNA的合成调控中发挥重要作用。另外，Fernandez Sainz1等为了探究Erns糖基化位点对病毒感染力和毒力的影响，对糖基化位点进行突变后发现，将N269用A或Q替换后会降低病毒的复制能力，毒力减弱，因而此糖基化位点对病毒的致病性具有重要意义。E2蛋白位于病毒粒子的外表面，具有跨膜区，不仅可与E1形成异源二聚体，还可自身形成同源二聚体。很多研究已经证明E2蛋白是猪瘟病毒一个重要的免疫蛋白，能够刺激机体产生中和抗体从而提供保护性免疫，因此研究人员对E2蛋白

19、的抗原区结构开展了广泛研究。E2蛋白含有个相对独立的抗原区，分别为A、B、C和D，而且A又有3个亚区（A1、A2和A3），其中，中和表位均位于A、B和C区，而且 A1、B、C还能够以一种协同的方式激发中和反应。E2蛋白基因上存在有6个假定的N-糖基化位点和一个 O-糖基化位点，而且对这些糖基化位点进行突变后会产生无活力的病毒粒子，单独的N-糖基化位点对病毒粒子的形成和毒力并不重要，但是对多个糖基化位点进行突变后会影响病毒的毒力和自我保护能力。Helle F等将疫苗弱毒株E2蛋白N-糖基化位点N1、N2、N4、N6和N11移除后，病毒粒子在与抗体发生中和反应时，表现出高度敏感性，说明这些位点能够

20、降低中和抗体与E2表位结合的亲和力，因此，N-糖基化位点在维持E2蛋白结构的完整性和增强其抗原性方面都发挥着相当重要的作用。此外Chang CY等研究发现，不同毒株之间的抗原特异性取决于B/C区，此区位于E2基因N端的90个碱基处，D/A区在猪瘟病毒不同毒株之间则相对保守，E2基因中692C和737C之间的二硫键连接以及序列771LLFD774对病毒的完整性以及 B/C的构象识别意义重大。近来，Deng M C等通过抗原模拟试验发现，E2 基因上还存在一个以前未知的抗原决定区，即753 RYLASLH-KKALPTSV767，其对表位识别构象形成的完整性十分重要，而且这段氨基酸序列在不同毒株间

21、都相对保守，或许是群特异性抗原的组成部分，这使我们对E2基因的抗原性又有了更深层次的了解E1是一类小分子质量蛋白质，分子质量约为33ku，能够与E2蛋白形成异二聚体。E1蛋白的二级结构对病毒的复制，细胞趋性以及病毒的传播都很重要，改变E1的二级结构可能会直接影响E1上的毒力决定基团，或者影响E1与E2或其他结构蛋白之间的相互作用，从而影响病毒的毒力。对猪瘟病毒的E1蛋白进行序列分析发现其有3个高度保守的糖基化位点（N500N513N594），并且有2个（N513N594）在 BVDV 型和型也同样保守，表明这些糖基化位点在瘟病毒属病毒成员中发挥着重要的作用。通过对糖基化位点进行突变发现，若3个

22、糖基化位点都进行突变后，将无法产生存活的子代病毒粒子，改造除N594之外的任一或两个糖基化位点后并不影响感染细胞中病毒粒子的形成和病毒的感染力，但是，如果单独改变N594 碱基或包含N594 碱基在内的任何2个碱基都会使病毒的毒力减弱，因此对糖基化位点进行定点突变也是研究弱毒疫苗的新思路C蛋白在多聚蛋白中位于N端蛋白酶Npro和糖蛋白Erns之间，其是一种富含有赖氨酸和精氨酸的小蛋白质。成熟的C蛋白含有86个氨基酸，分子质量为14ku，N端169Ser 在Npro自身酶活性的调节下被切除，紧随其后的是Erns，由信号肽催化产生N端268Asp，C蛋白是一种调节病毒转录的调节因子，参与病毒复制中

23、RNA结构重组，RNA组装以及病毒形态变化过程，在病毒的复制中发挥着重要作用。通过间接免疫荧光试验（IFA）和免疫过氧化酶单层细胞含量测定（IPMA）分析显示，CSFV 病毒粒子自身的C蛋白能与在大肠埃希菌中表达重组C蛋白作为免疫原产生的多克隆抗体发生反应，说明C 蛋白具有较强的免疫原性和反应原性，将C蛋白切割后发现，其表面含有一个线性表位，对应的氨基酸序列为61 TQDGLYHNKN70，而且此段氨基酸序列在瘟病毒属成员中高度保守另外进行激光共焦分析后还发现病毒粒子感染 PK-15细胞后，C蛋白主要位于细胞核质和核仁内，但 C蛋白进入细胞核的机制还没有确定，或许与核孔复合体的主动转运有关，这

24、还有待于进一步的研究。对 C蛋白进行测序，发现其中含有与莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）M蛋白具有同源性的碱基序列（标 记 为、 区），而且能够与核内蛋白质IQGAP1相互结合，Gladue D P 等为了研究 C 蛋白与IQ-GAP1结合是否对病毒毒力有影响，对、和区进行碱基替换后，发现病毒在原代巨噬细胞上呈现出缺陷生长，体外对和 区碱基替换后，病毒的毒力完全减弱，这表明 C蛋白与核内蛋白质IQGAP1的相互作用对病毒的毒力相当重要因此，对结合位点进行突变或许是弱毒疫苗研究的一个新方向Npro 蛋白是猪瘟病毒ORF编码的第一个蛋白质，分子质量为23ku，具有酶活性，能够在C端自身剪切产生病毒核

25、衣壳蛋白C的N端。在黄病毒科成员中，Npro 蛋白是瘟病毒属成员中的独特蛋白质，但其对于病毒的复制并不是必不可少的将Npro 基因切除或者用小鼠泛素基因替换后，这些猪瘟病毒的突变体在 SK-6 细胞上的生长特性并没有发生太大的改变，但是却失去了对猪的感染毒力，这似乎表明在病毒进化过程，Npro 与病毒的致病性存在密切 联 系 Ruggli N等通过研究发现猪瘟病毒的Npro蛋白不仅能够抵抗双股RNA介导的细胞凋亡，还能干扰IFN-/的诱导，重要的是，Npro还能够抑制人细胞中IFN-和IFN-启动子的表达，以及封锁由新城疫病毒介导产生的IFN-/，这都为病毒感染机体提供了帮助NS2蛋白自身具有

26、蛋白酶活性，并且与细胞内的分子伴侣Jiv联系密切，能够裂解NS2-3蛋白对于猪瘟病毒来说，NS2-3的加工过程发生在病毒感染的各个阶段，而且NS2-3以及其裂解产物的比例是动态变化的，不过通常是NS2-3的比例高于NS2和NS3NS2-3对于猪瘟病毒粒子的形成至关重要，但是一旦NS2从NS2-3前体蛋白中裂解下来，其本身在病毒生活周期中并没有其他重要的作用NS3蛋白则含有3种病毒复制必需的酶活性：位于N末端的丝氨酸酶活性，以及位于C末端的NTP酶活性和解旋酶活性另外，NS3还是一种IRES结合蛋白，它与IRES结合后能够增强其转录功能，但NS5A和NS5B能够降低此种促进作用。NS4A参与病毒感染粒子的形成过程，它与NS2-3共同发挥作用，是不可缺少的成分，而且将NS4A单独分离出来后其活性不会损失，在病毒RNA复制过程中发挥着重要作用NS4B能够通过调节宿主的免疫应答反应发挥毒力随后，Gladue DP等在NS4B蛋白中发现，其碱基序列的209-216和335-342位具有水解ATP和GTP的功能，而且这种NTP酶水解活性对病毒至关重要，如果将相应的碱基部位进行突变后，病毒就会失去感染能力或复制能力受到损伤，不能进行病毒复制，因而可以利用这一特性研究新型抗病毒策略以抵抗猪瘟病毒