大蒜素对痢疾杆菌抑菌作用和其机制初步探析

1、大蒜素对痢疾杆菌抑菌作用和其机制初步探析【摘要】目的：观察大蒜素对痢疾杆菌的抑菌效果, 初步探讨大蒜素的抑菌机制。方法：采用kb纸片法、液体 稀释法检测大蒜素对痢疾杆菌的抑菌效果及最小抑菌浓度 (mic)值；采用sds-page电泳法，观察大蒜素作用下菌体蛋白质电泳图谱的变化。结果:大蒜素对痢疾杆菌的抑菌环直径为 15. 3±1. 676305mm, mic 值为 100ug/ml,在 sds-page 中，大蒜素作用后，痢疾杆菌的蛋白图谱有变化。结论：大 蒜素对痢疾杆菌有抑菌作用，并影响菌体蛋白质的合成，初 步揭示了大蒜素的作用机制。【关键词】大蒜素；sds-page；抑菌机制；痢

2、疾杆菌志贺菌属细菌通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和 危害严重的革兰阴性肠道致病菌，临床感染可导致细菌性痢 疾(菌痢)。菌痢是世界上，尤其是发展中国家重要的传染 病之一，全球每年的病例超过1.6亿，并导致100万患者死 亡，其中绝大数为5岁以下的儿童1。目前，人们长期滥 用抗生素造成了严重菌群失调和药物不良反应，因此，寻找 一种不良反应少又有效的抗菌药物，是医学界努力的方向。 大蒜为百合科植物，含有丰富的营养物质，又具有很高药用 价值。原在法国、埃及等地早就用来佐餐、预防疫彷，秦汉 时期传人我国，我国食用大蒜及用大蒜治疗疾病历史悠久， 据本草纲目记载，大蒜有解毒散臃肿、消毒气、除风破 冷、健

3、脾治世等功效2。研究表明，大蒜抗菌的有效成分 是大蒜素。本研究主要观察大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用， 并对其抑菌机制进行了初步探讨。1材料与方法1.1材料 大蒜素（江苏正大清江制药有限公司）；福氏痢疾杆菌（本室保存，菌号：51571-10）；营养琼脂培养基、mh琼脂 培养基、mh肉汤培养基（北京奥博星责任股份有限公司）;过硫酸铁、冰醋酸（天津市百世化工有限公司）；temed、丙 烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、tris. sds、b-硫基乙醇、考马 斯亮蓝r-250 （艾勒科技有限公司）；甲醇（天津市科锐思精 细化工有限公司）；蛋白marker （北京鼎国盛生物技术有限 责任公司）；滤纸12仪器电泳槽（

4、北京六一仪器厂，型号dycz-24dn）,电泳仪（北京六一仪器厂，型号dyy-6b型），摇床。1. 3方法1. 3. 1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用1.3. 1. 1菌悬液的制备福氏痢疾志贺菌于营养琼脂培养基平板培养37°c 18-24h,用无菌生理盐水将新鲜平板培养物洗下，以mh肉 汤培养基制成浓度为1. 6x 106cfu/ml的菌悬液。1.3. 1.2大蒜素液的制备用mh肉汤培养基溶解大蒜素粉末，制成0. 5mg/ml的大 蒜素液，备用。1.3. 1.3大蒜素药敏纸片的制备将滤纸剪成直径为0.6cm的圆形纸片，12tc 20mins高 压灭菌冷却后，浸入上述大蒜素液中浸泡，备用3

5、。1. 3. 1.4 mh琼脂培养基制备将mh琼脂培养基粉末加蒸馆水溶解后，12tc 20mins 高压灭菌，冷却至约5(tc后注入120mm的玻璃培养皿中，待 凝固后备用。1.3. 1.5抑菌作用取lml上述浓度的菌悬液，涂布法均匀接种于mh琼脂 培养皿中，将大蒜素药敏纸片贴于培养皿中心处，379培养 24h后，测量抑菌圈的大小4。1.3.2测量大蒜素的最小抑菌浓度(mic)采用液体稀释法，制备含不同浓度的大蒜素mh肉汤培 养液，然后向各浓度的肉汤中加入实验菌悬液并混匀，于 37£培养24h后，观察其是否有菌落生长，细菌不生长的最 高稀释度为大蒜素的最低杀菌浓度。1. 3. 3 s

6、ds-page 电泳试验配制10%的聚丙烯酰胺凝胶5,将1.3.2中含大蒜素的 菌体及空白对照与等体积上样缓冲液混合后，经沸水浴 5mins,与10000r/min离心lmin,取上清上样，每孔30 u 1, 进行电泳。然后用考马斯亮蓝染色液染色3h,再脱色，观察 结果。2结果2.1表1大蒜素对福氏痢疾志贺菌的抑菌情况3结论3. 1大蒜素对痢疾杆菌的抑菌作用用k-b法初步检测大蒜素对痢疾杆菌是否有作用，从表 1中可以看出大蒜素对痢疾杆菌有一定的抑菌作用，其抑菌 环直径为 15. 3± 1.676305mm。3. 2测量大蒜素的最小抑菌浓度(mic)用液体稀释法检测大蒜素对痢疾杆菌的最

7、小抑菌浓度 应该为100ug/ml3. 3对最小抑菌浓度的培养物和没有加药的阴性对照进 行的sds-page可以看出在2-105kd中间有几条蛋白条带有 缺失或者降低的情况，说明药物可能作用于该位置上，从而 干扰细菌的增殖。4讨论目前，关于菌痢的确切发病机制尚未明确，国外学者研 究认为，痢疾杆菌的感染可能包括以下过程6-8： k痢疾 杆菌通过微皱褶细胞进入结肠粘膜，sansonetti等9发现 具黏附性而无侵袭性的痢疾杆菌变异株：bs15感染后，m细胞 伸展似一大口袋装，其内含有大量的单核细胞；2、定植的 巨噬细胞吞噬痢疾杆菌后发生凋亡，释放炎症因子，h订b订 等10发现lps与ifn-y可阻

8、止痢疾杆菌诱导的巨噬细胞 凋亡，其机制不清，可能与lps与ifn-y激活巨噬细胞、 增强其杀菌活性有关；3、痢疾杆菌侵袭临近的上皮细胞， 在其内增殖、扩散及导致年末损伤。细菌对抗菌药物的耐药性是自然界的抗生现象，其主要 通过4种方法产生耐药性：1、产生灭活酶或钝化酶，使抗 菌药物失活或结构改变；2、抗菌药物作用导致靶位改变或数目改变，使之不与抗菌 药物结合；3、改变细菌细胞壁的通透性，使抗菌药物不能 进入菌体内；4、通过主动排外作用，将药物排出菌体之外 11。大蒜素是一种天然广谱抗生素，其作用机制是抑制细 胞内硫基酶的活性，影响细菌的代谢，破坏其生长繁殖12。 本实验首先用k-b法发现大蒜素对

9、痢疾杆菌有抑菌作用，然 后又采用液体稀释法检测出大蒜素对痢疾杆菌的mic值。初 步探讨了大蒜素对痢疾杆菌有抑菌作用。自20世纪90年代首次提出“蛋白质组”概念以来，蛋 白质组学技术得到快速发展。"蛋白质组”研究是对基因组 研究的重要补充，它能在蛋白质水平定量、动态、整体性研 究生物体，是生命活动机制的分析工具。本实验分析了在大 蒜素作用前后，痢疾杆菌蛋白质图谱的改变，我们初步发现 有6-7个部位的蛋白发生了变化比较明显，为进一步大蒜素 对痢疾杆菌的作用机制，以及痢疾杆菌致病的分子机制研究 奠定了基础。参考文献：1 sansonetti pj. microbes and microbi

10、al toxinsj. am j physiol gastrointest liver physiol, 2001, 280 (3)： g319-g323.2 李时珍.本草纲目j.北京：人民卫生出版社， 1997.3 田玉成.精制大蒜杀菌效果的研究j实用预防 医学，1999, 6： 1.4 管远志，王艾琳，李坚.医学微生物学实验技术m. 北京：化学工业出版社，2005： 109-1145 卢圣栋.现代分子生物学技术m.北京：中国协和 医科大学出版社，2001： 352-356.6 hathaway lj, griffin ge, sansonetti pj, et al. human mono

11、cytes kill shigella flexneri but then die by apoptosis associated with suppression of proinflam-matory cytokine productionj infect inunun, 2002, 70 (7)： 3882-3842.7 zychlinsky a, thirumalai k, arondel j, et al. in vivo apoptosis in shigella flexneri infections j. infect immun, 1996, 64 (12)： 5357-53

12、65.8 san sone tti pj, tran van, nhieu g, egile c. rupture of the intestinal epithelial barrier and mucosal invasion by shigella flexneri j clin infect dis, 1999, 28 (3)： 466-475.9 sansonetti pj, arondel j, cantey jr, et al.infection of rabbit peyer ， s patches by shigella flexneri: effect of adhesive or invasive bacterial phenotypes on follicle-associated epithelium j. infect immun, 1996,64 (7): 2752-2764.10 hilbi h, chen y, thirumalai k, et al. the interleukin 1 b -converting enzyme , caspase-1 , is activated during shigella flexn