实验六用离子交换层技术纯化目的蛋白

1、实验六 用离子交换层技术纯化目的蛋白【实验目的】使学生掌握离子交换层技术纯化蛋口质的工作原理。学会筛选离子交换介质 的工作方法，以及优化离子交换层析过程的策略，获得具有教高程度的蛋口质。【实验原理】离子交换层析技术是一种分离纯化牛物物质的最常用的方法之一。由于此种 方法是一种建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上的分离方法，所以 它依赖于分离系统的ph高于被分离物质的pi吋，被分离物质带负电荷，可被 阴离子交换剂结合，相反，则同阳离子交换剂结合。牛物分子表面所带电荷即使 有很小的差别，也足以采用离子交换层析技术把它们分离开来。通过优化分离系 统的离子强度和ph值以及采用梯度洗脱方法可以使

2、离子交换层析的分辨力更 高。蛋白质是带有多个极性集团的大分子物质，在有多种蛋白质存在的蛋白质混 合物溶液中，每种蛋白质因其分子大小，氨基酸组成的差别，对同种离子交换 介质具有不同的离子交换吸附能力，接着于此种差别，我们就可以在特定的离子 交换层析技术环境下把目的蛋白分离出来。离子交换层析环境包括离子交换介质 的种类、交联度、蛋白质溶液和离子交换层析柱平衡液的ph值及离子强度等。 通过对离子交换层析环境的优化，可以使选择的离子交换剂在特定的环境下仅同 目的蛋白结合。而不同其他蛋白结合，或者仅同杂蛋白结合而不同目的蛋白结合。 然而，此种环境条件对大多数蛋白质来说是不易找到的。通常遇到的情况是，在

3、特定的条件下，离子交换介质既能与目的蛋白结合也能与杂蛋白结合，但是对两 者的结合量有所不同。在此种情况下，可以通过选用特异的洗脱条件选择性的将 目的蛋白或杂蛋白从离子交换层析柱上洗脫下来，而达到分离纯化目的蛋白质的 目的。离子交换剂同其反离子的结合能力因反离子的种类不同而有差别。例如强酸 性邙日）离子交换剂对h+的结合力比对nf的小；强碱性（阴）离子交换剂对 oh的结合力比对cf'的小；而弱酸性和弱碱性离子交换剂对上述离子的结合力 的大小同强酸性和强碱性离子交换剂相反。因此在应用离子交换剂时，采用何种 反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因素。蛋白质是两性离子物质，一种离子交换剂对它

4、的结合力取决于蛋白质的理化 性质和在环境中呈现的离子状态。当环境的ph值底于蛋白质的等电点（pi）吋, 蛋白质带正电荷能被阳离子交换剂吸附；相反，被阴离子交换剂吸附。在特定的 ph环境中，pi>ph,其值相差愈远，蛋白质的碱性愈强带正电荷愈多，愈易被 阳离子交换剂吸附。蛋白质是大分子物质，其溶液呈胶体状，因此用离子交换层析技术提纯蛋白 质时，应选择那些选择性好弱酸性或弱碱性离子交换剂。并且希望其交联度小， 孔隙大，以利于蛋白质分之渗透入交换剂的网孔中进行离子交换吸附。蛋白质在离子交换剂上的吸附和解吸附（洗脱）受环境中的ph值和离子强 度控制。因此，可以选择一种特定的环境条件促使蛋白质同离

5、子交换剂吸附；选 择另外一种环境条件（即改变ph或改变离子强度），使蛋白质从离子交换剂上 解吸附，由于蛋白质的种类无记其数，组成各异，很难找到一种适用于所有蛋白 质的离子交换层析条件（包括吸附和洗脱两种过程）。因此，每一种蛋白质的离 子交换层析过程，都需要利用小样法对过程进行优化。常用的小样法是在试管中 进行的而不是采用小型层析柱。通过改变离子浓度和ph值筛选最佳吸附和洗脱 条件。根据离子交换介质所带的反离子完全离子化的ph值范围，将其分类为强阳 强阴，弱阳和弱阴四种类型。离子交换介质离子化范围较宽的为强，较窄的为弱, 与反离子的结合强度无关。在利用离子交换层析技术分离纯化某种蛋白质的时候，首

6、先需要选择适宜的 离子交换剂。对蛋白质而言，可以选用阴离子交换剂也可以使用阳离子交换剂究 竟选用何种离子交换剂，要根据蛋白质的pi来决定。由于在研究工作开始时， 人们尚不知道目的蛋白质的pi,所以一般先在生理ph值下对阴、阳两种离子交 换剂都做小样实验。由于弱酸、弱碱性离子交换剂在生理ph值下的交换容量也 比较高，用来分离蛋白质时，其生物活性不易受损，所以常被进行蛋白质纯化工 作。pharmacia生物工程公司新近研制岀强阳sp型和强阴q型离子交换介质的 工作ph范围比弱阴deae和弱阳cm型的工作ph范围更宽，更易保持高交换 量。所以不少研究工作者倾向于使用一些新型离子交换剂、代替弱阳和弱阴

7、型交 换介质。在基因工程药物生产实践中，常常根据产品分离纯化过程的不同阶段的 样品性质和纯化目标来选择合适的离子交换介质。如下表所示：产品纯化 阶段样品性质/纯化冃标 及工作原则应选择的离子交换介质（推荐）捕获及产品粗 分离去除细胞碎片、快速浓缩、处理量越大越好， 最短时间内捕获产品，避免产品被降解，减 少核酸、内毒素对介质载量和uv检测的影 响。介质须耐受高粘度、流速快，对分辨率 的要求不高sepharose 大颗粒（200pm） 交换剂可在短时间里处理 大量样品，阳离子交换剂 和亲和介质可在捕获产品 的同时，去除核酸。中度纯化以高选择性离子交换介质去除主要杂蛋白， 须注重介质载暈和分辨率z

8、间的平衡，介质 流速不是重要的选择指标sepharose ff (90mm)话官 用于早期纯化， sephanrose hp (34pm)可 提供更高的分辨率精细纯化去除多聚体，异构体，所有杂质必须减低至 药屮标准。交换介质的分辨率应高，流速不 重要source lm 30,15 sephadex sephacry r 凝胶过滤 介质通过小样试验确定了最适离子交换剂以及吸附/洗脱的最适层析条件之后，接 下来的工作便是确定离子交换层析柱的尺寸，样品溶液上样体积以及洗脱也流速 等。离子交换层析柱的柱床体积，即离子交换剂的装柱量，由离子交换剂的交换 量和样品溶液屮待分离蛋口质的含量决定。在溶液成分复

9、杂时，必须使离子交换 剂的交换量留有充分的余地。因此层析柱的实际交换量只能是理论交换量的 25-50%o在要分离的蛋口质溶液的成分复杂，目的蛋白质与杂质蛋口质性质相 似时，则实际交换量应设定得更低。离子交换层析柱屮的离子交换剂的用量可以 用下式来计算：aw= (1 )bxcxm式中：w离子交换剂的装柱量，mla冃的蛋白质的含量mgm目的蛋白质的分子量dalb单位重量的离子交换剂的理论交换当量亳克当量/mlc系数一般取5%50%离子交换层析柱的高径比多为10： 1。根据下式可以计算出层析柱的直径和高度:式中：h层析柱离子交换剂的装填高度cmw所需交换剂的装柱量(由式(1)求得)，ml兀3.141

10、61贝9,柱的直径d= h10离子交换层析柱洗脱液流速一般由离子交换介质的性质、操作压力、层析柱 的体积和待分离蛋白质决定的。流速大小可以用体积流速(mlcnf2hj)或线 性流速(cm/h)表示。对体积不同的层析柱来说，体积流速不能直接用作比较， 所以常用线性流速表示，两种流速的换算关系如下：体积流速(ml cm'2 h1)层析柱横断面面枳(cm2)线性流速 (cm-h'1)=流速过犬会降低层析柱的分辨力。其最佳值，需实验确定。一般采用5- 10cm h_io【实验器材】1.5ml eppendorf离心管8支、10x 15带螺旋盖的试管一支、试管架、1ml、 5ml刻度吸管

11、各5支、吸头、紫外分光光度计、sds-page装置、425x300玻 璃层析柱、铁架台、木工水平尺、螺动泵、核酸蛋白质检测仪、部分收集器【实验试剂】1. 蛋白质溶液为实验六得到的脱区硫酸镀的目的蛋白质溶液；2. 20mm磷酸缓冲液ph7.53. 2m naci磷酸缓冲液：将固体nacl添加到20mm的磷酸缓冲液中， 使naci的浓度为2m4. 离子交换树脂：弱酸性cm sephadex c弱酸性 deae sephadex a505bradford试剂：称取loomg考马斯亮兰g250,将其溶于50ml 95%乙醇 中后，添加100ml 85%磷酸，加双蒸水至1000mlo【实验方法】1. 层

12、析条件的优化a.吸附条件的确定(1) 将 5ml cm-sephadex c-50 凝胶或 deae-sephadex a-50 凝胶(本实验选 用后者)置于一带有螺旋盖的©10x15试管中添加5ml 20mm磷酸缓冲酸(ph7.5),颠倒试管数次后，将试管直立地放置在试管架上，让凝胶自然沉淀， 用带吸头的5ml吸管移去凝胶上部的缓冲液；(2) 重复上述洗涤操作10次；(3) 将200 u 1凝胶分别转至五个1.5ml eppendorf离心管中,分别编号为12、3、 4、 5；(4) 向每个离心管屮添加500 u 1脫盐的目的蛋白溶液；(5) 向各号、离心管中添加总体积为400 u

13、 1的不同量的200mm磷酸缓冲液 和含2mnacl的磷酸，使naci的终浓度分别为50mm、100mm、200mm、300mm 和 400mm(6) 颠倒离心管510次以充分混合其屮的内容物，然后直立离心管，静置, 使凝胶沉于管底。重复上述操作两或卷次，总时达15min(7) 在高速离心机中，离心12分钟，从每个离心管中取50 u1上清，制 备sds-page样(一脱盐后的目的蛋白作对照)(8) 作sds-page分析，观察目的蛋白和杂蛋白在各管中的分布情况，选择上 清屮杂蛋口多，目的蛋口少的一管的盐浓度作为上柱时的洗柱缓冲液。b.洗脱条件的确定(1) 将操作中剩余的deae-scphadc

14、x a50凝胶分装于五支eppcnclorf 离心管屮，每管200 u 1；(2) 向每管添加500 u 1脱盐的目的蛋白溶液,添加400卩1含浓nacl的磷 酸缓冲液，使nacl的终浓度为中测定的最佳吸附nacl浓度，重复a (6) 操作后，离心除去上清；(3) 分别向管1、2、3、4和5中加入ph值为5. 8、6. 4、6. 8、7. 5和80 的含有于吸附时相同浓度nacl的磷酸缓冲液lml,重复a (6) (8)操作，观 察目的蛋口洗脱情况。(4) 选择目的蛋口质洗脱量最高的缓冲液作洗脱用缓冲液；2 装制离子交换层析柱(1) 根据测定的fi的蛋口质在实验六得到的脱盐蛋口质溶液屮的含量和

15、本实 验“1”选顶的离子交换剂的吸水量技术出所需层析柱的尺寸；(2) 将根据装柱量技术出的干离子交换剂用蒸馆水浸泡三小时后，补加过量 的水，搅拌使交换剂悬浮后，静止放置，使交换剂颗粒沉降，小心倾倒交换剂表 而的上清以除去细微的颗粒。(3) 如果选用的离子交换剂是弱酸性的，则向用水浸泡过的交换剂中假如2 倍体积的0. 5niol/l盐酸，在室温下处理30分钟后，倾去演算反复用蒸績水漂洗 交换剂，直至漂洗水呈中性后，假如0. 5mol/l naoh浸泡30分钟后，倾去碱液, 用蒸馆水漂洗至中性，如果选用的离子交换剂是弱酸性的，则先用naoh处理， 再用iic1处理。起冃的是使弱酸性交换剂带的反离子

16、是nf,而弱酸性交换剂以 c1-作为反离子，以增加交换剂的交换量。(4) 将玻璃层析柱洗净后垂直地固定在铁架台上，用木工水平尺校正垂直度。 关闭柱下出液阀门，向柱屮灌注蒸镭水，使液面至1/2柱高，如柱底部有气泡存 在，可采用开启出液阀排除。将处理好的交换剂灌注如层析柱中，待交换剂下沉 在柱底形成2-3厘米厚的交换剂后，打开底阀让水一 40n)l/h的速度流出，并随 时将剩余的交换剂悬浮液添加到层析柱屮，使交换剂装填均匀、无气泡。(5) 关闭柱底岀液阀，向柱内灌注蒸馆水至柱顶；盖上柱顶塞，并用导管同 输液量以调整至40ml/h的蠕动泵向联，打开柱底岀液阀开动蠕动泵，使二倍柱 床体积的蒸镭水通过层

17、析柱；(6) 关闭蠕动泵，并取下柱顶塞，让柱顶上的蒸憎水的弯月而降至与主厂顶 面向切，关闭底部出液阀，将已脱盐的蛋口质溶液沿柱壁小心添加到柱床上。打 开柱底出液阀，使样品液面下降至柱床顶面，用少量洗柱液(其成分由本实验“1” 确定)小心冲洗柱壁，使粘在柱壁上的样品完全进入柱床；(7) 关闭柱底出液阀后，小心讲洗柱液灌注如柱床顶部空间后塞上柱顶塞， 并将其与上述蠕动泵相联。打开柱底出液阀，开动蠕动泵，将2倍柱床体积的洗 柱液送入层析柱，洗去未被吸附的杂蛋白；(8) 将柱底岀液毛细管通过核酸蛋白质检察仪同分部体积已调至1. 5ml的部 分收集器相联后，将蠕动泵吸液管插入到洗脱液瓶中(洗脱液成分通过“1”确 定)，开动部分收集器和蠕动泵，以及核酸蛋白质检察仪，用2倍体积的洗脱