血清r-球蛋白提纯

1、主讲：刘畅主讲：刘畅 实验报告要求：题目，组号题目，组号实验目的：实验目的：实验原理：实验原理：实验操作：如实记录实验操作：如实记录实验结果及结果分析：实事求是实验结果及结果分析：实事求是讨论或小结：讨论或小结： 生化实验内容安排第一实验室第一实验室DEAEDEAE离子交换层析法分离血清蛋白质离子交换层析法分离血清蛋白质第二实验室第二实验室血清血清球蛋白提纯、醋酸纤维素薄膜电泳球蛋白提纯、醋酸纤维素薄膜电泳第三实验室第三实验室聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第四实验室第四实验室蛋白质的比色分析、血清脂蛋白电泳蛋白质的比色分析、血清脂蛋白电泳第五实验室第五实验室基因组基因组DNA的提取及鉴定

2、的提取及鉴定第六实验室第六实验室酶促反应动力学实验酶促反应动力学实验一、血清球蛋白的提纯二、醋酸纤维素薄膜电泳分离 血清蛋白质第二实验室实验十七实验十七 血清血清球蛋白的提纯球蛋白的提纯l技术关键及提纯过程的主要原理技术关键及提纯过程的主要原理二、脱盐二、脱盐一、盐析一、盐析(Salting out)(Salting out)、离心分离离心分离操作注意操作注意实验原理实验原理操作注意操作注意实验原理实验原理l提问式小结提问式小结三、检测与分析三、检测与分析四、浓缩四、浓缩血清血清-球蛋白的提纯球蛋白的提纯实验八实验八 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 -分离血清蛋白质分离血清蛋白质 目的目

3、的 熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的基本熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理及电泳分离血清蛋白质的方法。原理及电泳分离血清蛋白质的方法。一、电泳的基本原理一、电泳的基本原理1 1、电泳、电泳 指带电颗粒在电场中向着与其所带电荷极性相反的指带电颗粒在电场中向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动的现象。电极方向移动的现象。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团核苷酸、核酸等都具有可电离基团; ;在电场的作用下，这些带电粒子会向着与其所带在电场的作用下，这些带电粒子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电荷极性相反的电极方向移动

4、。2 2、影响电泳速度的因素、影响电泳速度的因素内在因素内在因素: : 样品自身性质样品自身性质外在因素外在因素: : 电场电场 缓冲液缓冲液 支持介质支持介质二、血清蛋白质的分离二、血清蛋白质的分离1 1、蛋白质的两性解离性质、蛋白质的两性解离性质蛋白质分子两端的氨基和羧基蛋白质分子两端的氨基和羧基氨基酸残基侧链中某些基团氨基酸残基侧链中某些基团在一定的溶液在一定的溶液pHpH条件下条件下解离成带负电荷或正电荷的基团解离成带负电荷或正电荷的基团2 2、蛋白质的等电点、蛋白质的等电点( pI) ( pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpH时，蛋白质时，蛋白质解离成正、负离子的趋

5、势相等，即成为兼解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的性离子，净电荷为零，此时溶液的pHpH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。3、血清蛋白质血清蛋白质1 1）各蛋白质的分子量各蛋白质的分子量清蛋白清蛋白(69.000)(69.000) 1-1-球蛋白球蛋白(200.000)(200.000) 2-2-球球 蛋蛋 白白(300.000)(300.000) - -球蛋白球蛋白(90.000-150.000)(90.000-150.000) - -球蛋白球蛋白(156.000-950.000)(156.000-950.000)2 2）各血浆蛋白质的等电点）各血浆蛋白

6、质的等电点清蛋白清蛋白 1-1-球蛋白球蛋白 2-2-球蛋白球蛋白 - -球蛋白球蛋白 - -球蛋白球蛋白分类分类pIpIpH8.6pH8.6 组成比例组成比例5656一一62624 4一一7 79 9一一11111111一一15151212一一16%16% 4.64 4.64 5.06 5.06 5.12 5.126.85-7.36.85-7.3 A 清蛋白清蛋白 1 2 清蛋白清蛋白 1 2 B血血 清清 蛋蛋 白白 电电 泳泳 图图 谱谱1 1电泳介质电泳介质 醋纤膜的准备醋纤膜的准备醋酸纤维素膜（醋酸纤维素膜（2 28cm8cm）放入放入pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液

7、 操作操作 操作操作 2 2样品样品1)-1)-球蛋白球蛋白 前面分离提纯、浓缩前面分离提纯、浓缩2)2)血清血清: :对照对照 操作操作 3 3、点样、点样注意：点样量注意：点样量 适度适度 过多：拖尾和扩散过多：拖尾和扩散 过少：则无法检出过少：则无法检出1.5cm1.5cm粗糙面点样粗糙面点样 操作操作 4 4、电泳、电泳注意注意 1 1、薄膜条要绷紧，避免中间下垂、薄膜条要绷紧，避免中间下垂 2 2、缓冲液与醋纤膜之间用滤纸搭桥、缓冲液与醋纤膜之间用滤纸搭桥 3 3、盖上电泳槽盖平衡、盖上电泳槽盖平衡 4 4、接通电源，调整电压到最大，调整、接通电源，调整电压到最大，调整 电流为电流为0.5-1mA/0.5-1mA/条醋纤膜）条醋纤膜） 5 5、时间：、时间：30-40min30-40min将点好祥的醋纤膜点样端放进电泳将点好祥的醋纤膜点样端放进电泳槽架槽架负极（黑色）负极（黑色） 操作操作 操作操作 （四）显色与脱色（四）显色与脱色1 1、显色显色氨基黑氨基黑10B10B（1-2min1-2min）2 2、脱色、脱色5%5%冰醋酸漂洗冰醋酸漂洗3 3次次注意：用干净镊子夹电泳槽中的膜注意：用干净镊子夹电泳槽中的