Why is it difficult to Derive Pluripotent Stem Cell in Domestic Ungulates？

1、Why is it so Difficult to Derive Pluripotent Stem Cell in Domestic Ungulates？ContentIntroduction机体器官通过小细胞群包括器官特异性的细胞或成体干细胞来抵消器官在生理学上的消耗。根据其发育潜能分为单能干细胞和多能干细胞，单能干细胞只能分化形成一种特定的细胞类型，多能干细胞能形成三胚层的任意细胞。当干细胞开始进行定型时，三胚层的细胞被定义为多能性。但多能性局限于上胚层，所以稳定的多能性细胞只存在于体外而非体内(Smith2001)。True Embryonic Stem Cells目前只从小鼠，人和非人

2、灵长类动物胚胎中分离获得了真正意义上的胚胎干细胞(ESC)。所有这些物种建立的细胞系具有共同的特性：能够在体外进行自我更新，能够分化形成组成机体的所有组织类型，表达OCT4、SOX2、NANOG等多能性因子，将其注入免疫缺陷的小鼠中能够形成畸胎瘤。而灵长类物种ESC与小鼠的ESC相比具有明显的不同。首先是培养基的不同，小鼠ESC依赖于LIF和BMP4，通过激活JAK/STAT3信号通路来维持细胞的增殖并不分化，而此通路的激活反而会促进灵长类ESC的分化。灵长类ESC多能性的维持需要细胞因子FGF2和激动蛋白A，依赖于Nodal信号通路的激活。小鼠ESC只能从特定的允许型鼠系分离获得，而人和灵长

3、类动物具有特异的基因背景，在ESC的分离上没有局限性。小鼠和灵长类动物ESC在形态上存在差异性。小鼠ESC形成的克隆集落细胞排列紧密，呈凸起状，而灵长类ESC的克隆集落较大，呈扁平状。mESC分离成单细胞后能够继续增殖，但对灵长类ESC来说将会致死，灵长类的ESC克隆集落需要机械地剥离饲养层，不能消化成单细胞。一般而言，mESC其生命力旺盛，易于适应培养环境。而灵长类ESC生长比较缓慢，对培养环境比较敏感。mESC最显著的特征是能够形成嵌合体，当ESC处于较好的细胞状态时，能够产生生殖系嵌合体。也有很多人尝试非人类灵长类ESC的嵌合体制备但均以失败而告终。近来已被证实罗尾猴ESC不能整合入整个

4、囊胚，但首次获得了四细胞胚胎的嵌合体。这表明灵长类ESC是由于不能形成单细胞而不是因为其可塑性较低。事实上，小鼠ESC以单细胞悬液的形式注入囊胚产生嵌合体。相反，灵长类动物ICM不能以单细胞悬液的形式存活，同样对于其ESC也是不可能的。因此，不论在体内ICM中还是体外ESC中，灵长类多能性干细胞对特异细胞粘附信号的依赖导致不能形成嵌合体。我们总结了不同物种ESC的不同特性(如表1)，但究其原因一直没有大量的研究对此作出解释，直到Brons等，Tesar等人从植入前小鼠胚胎(E5.5-E7.5)上胚层分离获得了多能干细胞，这相对于标准的植入前小鼠胚胎(E3.5或更早)是一项突破，获得的细胞系称为

5、上胚层干细胞(EpiSC)。EpiSC细胞系的培养依赖于激动蛋白A和FGF2细胞因子，其克隆集落的形态也与之前获得的细胞系不同，并且对于单细胞消化具有敏感性，不能形成嵌合体，这些特征区别于人类和非人类灵长类ESC的特性，与小鼠ESC也不同。EpiSC依赖于细胞粘附信号，不能以单细胞形式存活，不能形成嵌合体。以上这些为啮齿类和灵长类ESC的差异性提供了生物学解释。现在清晰的是两类细胞是从胚胎发育的不同时期分离的：一类被称为原始型(naive)，存在于植入前小鼠胚胎囊胚；一类被称为受训型(primed)，存在于灵长类植入前囊胚和小鼠植入后胚胎。目前大家公认的是灵长类ESC更接近于小鼠EpiSC而不

6、是小鼠ESC的干细胞状态。How can we explain the fact that mouse pre-implantation blastocysts give rise to ESC but primate pre-implantation blastocysts give rise to EpiSC?(为什么小鼠植入前囊胚能够产生ESC而灵长类植入前囊胚产生EpiSC?)目前存在一假说，从胚胎分离的细胞在体外培养时会发生进一步的分化。事实上，虽然Brook和Gardner证实mESC来源于上胚层细胞，小鼠胚胎2.5天时没有形成上胚层，在第3.5和4.5天胚胎时期已经形成上胚层，但

7、是从2.5天小鼠胚胎分离获得的ESC与从3.5天和4.5天胚胎分离获得的ESC相比不存在明显的差别。这些表明细胞在体外缺乏体内胚胎环境的条件下可能会自发进入上胚层阶段。有研究证实将mESC培养在含生长因子FGF2和激动蛋白A的培养基中能够分离出EpiSC，表明EpiSC是ESC在生理学上的进化结果。事实上，在缺乏LIF和FGF2条件下，将3.5天小鼠胚胎的ICM培养2周，期间对其进行轻微的细胞解离，最终能够分离出EpiSC。在后期阶段如果添加FGF2细胞因子能够加速EpiSC的生长，但如果添加LIF会促进mESC的生长。因此，我们推测，从灵长类植入前囊胚分离的细胞，假定像小鼠内发生的一样是起始

8、于原始型的上胚层，将这些细胞进行体外培养，在产生稳定的细胞系之前这些细胞会自发地进入受训型上胚层阶段，这样最终分离获得的干细胞称为EpiSC。The next question is what makes rodents different from allother mammalian species when it comes to derive ESC?啮齿类动物早期胚胎发育有两个显著特征：形成卵圆筒结构；早期胚胎进入休眠状态额滞育期。对于其它哺乳动物，在胚胎发育过程中囊胚形成后，上胚层分成细层与下胚层一起形成扁平状的多层结构胚盘。啮齿类动物胚胎，在发育过程中上胚层进行重排，形成杯状结构

9、包绕在下胚层周围，构成卵圆筒胚胎。胚胎的这种特殊结构及其相关的形态上的变化可能在很大程度上延迟了从原始型(naive)上胚层向受训型(primed)上胚层的转变，所以当在植入前囊胚进行细胞分离时，细胞正处于原始型时期从而获得真正意义上的ESC。相反，对于其它哺乳动物胚胎形成扁平状的胚盘结构，会加速由原始型向受训型的转变，在分离细胞时很难抓到时机，往往错过了原始型时期，得到的都是EpiSC细胞系。啮齿类动物母体如果在泌乳时妊娠，此时胚胎会自发地进入滞育期，也可以用实验的方法通过降低雌二醇的分泌水平同样可以阻止胚胎的发育，导致的结果是胚胎停止在囊胚阶段并且不会着床。在这种情况下，上胚层在子宫壁分泌

10、的LIF的作用下保持较低水平的自我更新，在体外环境下，上胚层细胞在LIF因子的刺激下能够进行自我更新，这看似是一种生理学上的适应现象。What Happens if you are not a Rodent or a Primate?近三十年来的研究发现分离获得真正意义上的ESC是非常困难的。近年的一些研究报道总结了不同的尝试方法，从第一次在猪上的尝试，一直到等人。在大多数情况下，分离获得的类ES细胞系表现出一些不足之处，例如在培养过程中传代次数受限，不能长期维持其多能性，并且不能产生生殖系嵌合体。尽管有很多相关的报道，但目前为止仍然不清楚为什么不能从有蹄类动物胚胎分离获得真正意义上的ESC。

11、正如之前所述，从上胚层分离得到的ESC是原始型或受训型，从而提出这样一个问题，即是因为缺乏适当的培养条件还是因为有蹄类动物的上胚层有其本身的特异性使得分离得到的细胞无法在体外进行培养。目前关于胚胎上胚层的形成机制已经非常清楚，特别是在小鼠中。小鼠胚胎第一次分裂，所有的卵裂球在发育上都是同等的，都具有全能性并表达转录因子OCT4。由全能性的卵裂球分化形成TE和ICM两类细胞系是胚胎细胞的第一次分化，其标志性事件是OCT4在CDX2的抑制作用下局限表达于ICM，导致的结果是TE细胞表达CDX2而ICM细胞表达OCT4。然后ICM细胞将进一步分化形成上胚层和下胚层，其中OCT4只局限表达于上胚层中。

12、具有多能性的上胚层在体内能够最终分化形成三胚层细胞，在体外能够分离获得灵长类和啮齿类ESCs。小鼠胚胎在发育到第3.5天时形成上胚层，并且OCT4局限表达于此。在第5.5天时，小鼠胚胎植入子宫壁，即开始着床。人的胚胎其过程与小鼠类似，但历时较长一些，在人胚胎第6天时形成上胚层，同样OCT4局限表达于上胚层，在第7-9天开始着床。当检测牛胚胎中OCT4的表达情况时发现OCT4并不像小鼠和人一样局限表达于ICM中，在扩展囊胚的ICM和TE中都有其表达。Berg等人发现在牛胚胎中，只在第11天胚胎时，OCT4才局限表达于上胚层中，而Hall等人发现猪胚胎中OCT4的局限性发生在第8-9天胚胎期。牛胚

13、胎在第10天时，下胚层完成发育，发育到第12天时滋养层上覆即Rauber层消失，使得上胚层完全暴露于子宫腔内，直到胚胎发育到第21天时才开始发生着床。这一过程与人和小鼠的截然不同，并且对于一些基因的功能也产生了一定的影响。Berg等人通过一系列复杂的遗传学和胚胎学技术研究发现牛OCT4上游调控区与小鼠中不同，包含一段特殊的短序列，对于阻止牛上胚层中由于CDX2的抑制作用而导致OCT4的下调是非常必要的，不像小鼠TE中由于CDX2的存在抑制了OCT4的表达。并且将小鼠oct4基因与牛的OCT4上游调控区相结合，导致小鼠囊胚中OCT4在ICM和TE中都表达，失去了局限性。不同的物种间上下胚层的分化

14、存在差异性。在小鼠中，这一过程由Fgf调控，通过激活促细胞分裂原活性蛋白酶引起Gata6的表达并抑制Nanog的表达。在人中，小鼠中的这些因子都不能作为配体发挥作用，目前还不清楚人胚胎上胚层形成的调控机制。在牛中，FGF抑制了NANOG的表达，但并没有影响到GATA6的表达。物种在发育上的时机及其分子调控的差异是否会影响牛以及其它有蹄类动物ESC的成功分离，并且又是怎样发挥作用的，这些都是人们容易关注的问题。在早些的研究中，有人尝试从来源于延伸猪囊胚的上胚层细胞分离猪ESC，但都没有得到实质性的进展。最近Alberio等人尝试用第10-12天延伸猪囊胚分离ESC，此阶段胚胎的上胚层受体与LIF

15、相比更好的与FGF2结合。实验结果非常的鼓舞人心，分离得到的细胞系自我更新能力较强，并能分化形成三胚层前体细胞、滋养外胚层以及生殖细胞前体。此外LIF/JAK/STST3信号通路的抑制对获得的细胞系的生长没有任何作用说明此细胞系属于EpiSC类型。这说明，对于猪或者可能其它的有蹄类动物，在分离ESC时其培养系统与灵长类动物的相接近。将小鼠EpiSC培养在ESC的培养基中，EpiSC最终会转变为ESC，鉴于此，如果猪EpiSC也具有同样的可塑性将给猪ESC的获得提供可靠的来源。但是目前为止不清楚猪ESC适宜的培养条件，因此具有一定的困难。近来研究假定的猪ESC大多数都是利用LIF和FGF2或者利

16、用LIF、FGF2激动蛋白和EGF。因此这些小分子各自的作用都已了解的非常清楚，我们检测了其中一部分基因的表达模式。结果显示，在获得的细胞系中FGF2受体持续表达，这进一步说明假定的猪ESC对培养条件的需求与啮齿类动物相比更接近于灵长类动物。与此一致的是，实验中也没有检测到LIF受体复合物（LIF受体与GP-130形成的异源二聚体）的存在。此外，在培养基中添加LIF细胞因子后，在体外培养时会阻止细胞分化形成类胚体，说明LIF因子能够以某种方式阻止细胞的分化。另外实验结果还检测到PI3K、AKT和PTEN的表达，这三个基因属于PI3K/AKT信号通路，Brevini等人证实LIF因子也作用于此信

17、号通路。Welham等人证实LIF因子通过激活PI3K信号通路使NANOG的表达上调，促进小鼠ESC的增殖和生长。这一结果并不与FGF2的作用相矛盾，因为有研究发现FGF2同样可以激活PI3K/AKT信号通路的级联反应。综合不同实验室对LIF和FGF2的联合使用的研究结果显示，除了FGF2的作用外，FGF2与LIF协同促进细胞的自我更新。Lets Do Without the Embryo目前总结的数据显示有蹄类动物植入前胚胎特异的形态及功能特征对于其ESC细胞系的建立可能具有深远的影响。推测有蹄类动物具有一个第三阶段，不同于原始型和受训型上胚层，其本身的特征阻碍了细胞向多能性细胞系的转变。诱

18、导多能性概念及技术的出现，可以将其应用到有蹄类动物多能干细胞的获得上。Takahashi和Yamanaka将四个关键基因oct4、sox2、klf4和c-myc转入体细胞并将其诱导产生多能性干细胞。在小鼠和人上，此技术已得到广泛应用，但在农场动物上的应用进展缓慢，一直没有取得显著的进展。目前，已成功获得部分有蹄类动物包括猪、绵羊、奶牛、马的iPS细胞，具体的实验方法和结果不尽相同(表2)。在很多情况下，得到的多能性细胞内的外源性多能基因并没有下调，将一直表达下去。一方面，这些基因诱导产生畸胎瘤的几率比较低，再者有研究表明在缺乏多能性基因的情况下猪、绵羊、奶牛的细胞系会迅速分化。Telugu等人研究发现通过体细胞诱导