western blot步骤

1、蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析Western Blot基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot应用：目的蛋白的表达特性分析，目的蛋白与其它蛋白的互作，目的蛋白的组织定位，目的蛋白的表达量分析。 Western Blot 流程 ：蛋白样品的制备，制胶，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗杂交，二抗杂交，底物显色。 （一）蛋白样品的制备： 提取总蛋白:所有操作在冰上进行, 且所有操作要对着容器壁操作，防治将细胞吹落；操作前先用PBS将细胞洗2变。1.将原瓶/皿中放入5ml生理盐水或PBS，根据细胞团块大小

2、加入100-300l RIPA裂解液，吹匀后，4摇床30min。 2. 4，12000×g 15min，离心后取上清，测浓度。 BCA蛋白浓度测定方法：原理 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在570nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 特点 1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1-20微升。 2. 在50-2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。 步骤(标准品为BSA，标准品稀释液为生理盐水) 50体积BCA试剂A（碧云天）加1体积BCA试剂B（碧

3、云天）（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀； 完全溶解蛋白标准品(即BSA)，取10微升稀释至100微升(生理盐水稀释) ，使终浓度为0.5mg/ml； 将标准品按0， 1， 2， 4， 8， 12， 16， 20微升加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升(此时浓度分别为0 0.5 1 2 4 6 8 10); 加适当体积样品(1微升)到96孔板的样品空中，加标准品稀释液到20微升; 各孔加入200微升BCA工作液，37放置30分钟; 测定570nm处的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 完全溶解蛋白标准品（即BSA），取10微升稀释至100微升（生理盐水稀释），

4、使终浓度为0.5mg/ml标准蛋白（l）01248121620生理盐水（l）2019181612840BCA工作液（l）200200200200200200200200 样品 （l）11111111生理盐水（l）1919191919191919（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.1mlRIPA裂解液：0.5M Tris-HCl pH7.5， 150mM NaCl， 1% NP40， 0.5% 去氧胆酸钠， 0.1%SDS)加入10l PMSF(配成0.1M的甲醇溶液)1. 30%丙烯酰胺: 丙烯酰胺(Arcylamide)29.2g，N，N-亚甲双丙烯酰胺(Bis-Acry)0.8g/100 m

5、l(丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关) 2. 10SDS: 10gSDS溶解于100 ml的ddH2O(阳离子去污剂:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠) 3. 上层胶缓冲液(upper gel buffer): 6.055gTris-HCL/100ml， PH 6.8 4. 下层胶缓冲液(low gel buffer): 18.2 gTris-HCL/100ml， PH 8.8 5. TEMED(催化剂) 6. 10%过硫酸铵(AP): 0.1g溶于 1ml消毒后的ddH2O (促凝剂) 7. 1

6、* Running buffer: 3.03g Tris-base， 14.4g甘氨酸/1L，1L加10SDS 10ml（现配现用） 8. Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 1*Running buffer ，10%SDS 9. 转移液（转膜用，一张膜）用:10%甲醇+20*Transfer Buffer12.5ml+ddH2O=250ml10. 6*SDS凝胶加样缓冲液: 300mmol/L Tris-HCL(6.8)，600 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，12%SDS，0.6%溴酚蓝，60%甘油 11. 10*TBS 缓冲液:24.2g Tris-base， 80g NaCL/1LddH2

7、O， PH 7.6 12. 1*TBST（洗膜用）：1*TBS， 0.1% Tween20（1L加1ml） 1）制备SDSPAGE： 下层胶上层胶7.5%*2*310%*2*312.5%*2*315%*2*45%*2*3*4双蒸水（ml）4.0 8.0 12.0 3.3 6.6 9.9 2.7 5.4 8.1 2.0 4.0 8.0 2.3 4.6 6.9 9.2 Gel buffer（ml）2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 6.0 2.0 4.0 8.0 1.0 2.0 3.0 4.0 BIS（丙烯酰胺）（ml）2.0 4.0 6.0 2.7 5.4 8.1 3

8、.3 6.6 9.9 4.0 8.0 16.0 0.67 1.34 2.01 2.68 10%SDS（l）90 180 270 90 180 270.0 90 180 270 90 180 360 40 80 120 160 10%AP（l）60 120 180 60 120 180.0 60 120 180 60 120 240 20 40 60 80 TEMED（l）6 12 18 6 12 18.0 6 12 18 6 12 24 8 16 24 32 标准蛋白（l）01248121620生理盐水（l）2019181612840BCA工作液（l）200200200200200200200

9、200 样品 （l）11111111生理盐水（l）19191919191919192）蛋白质样品的处理： 加样配制： 总体积：20l -巯基乙醇（-me） 2 l6×SDS样品缓冲液 3l 蛋白取量:取一组蛋白中，蛋白浓度最低为基础，取15l,其余的以15*(基础浓度/其余样品浓度) 剩余的体积用双蒸水ddH2O补齐 混和后100煮沸5 min。分装后4保存，可以减少反复冻溶蛋白降解。 在电泳槽内加入电泳缓冲液，检查胶漏不漏，加样：每泳道加样量70-80g(15孔30l，10孔50l)，且每泳道样品蛋白总量相等。若样品和Marker总数(5l)不足泳道总数，剩余的泳道可用补齐液补齐（

10、配制与样品一致，蛋白部分用ddH2O补），接通电极，上层胶80V，30-45min，下层胶110V， 溴酚蓝指示剂迁移到分离胶下游边缘时，停止电泳。 3）转膜：湿法(需在冰中进行) 将适当大小的 PVDF膜 （8.3cm×5.2cm，经甲醇预浸泡60秒）和下层凝胶浸入转移缓冲液平衡15-30min，按照夹心法由下至上依次将海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵顺序放好，细心赶去膜和胶夹心内气泡，擦干周围水。 恒压转膜（30V,1小时45分钟）4）封闭：1*TBST+ 5%（5g/100ml质量体积比，下同）脱脂奶粉，将硝酸纤维素膜放入封闭液中，置于摇床上，室温封闭1-2h。PBST

11、(TBST)洗涤5min×5次(23次即可) 5）按照分子量的大小剪取需要的膜条段 6）一抗封闭：用1*TBST+5%脱脂奶粉稀释 一抗1：1000置于摇床上，60次/ min， 4 过夜。PBST(TBST)洗涤5min×5次 （2次即可）7）二抗封闭 用1*TBST+5%脱脂奶粉稀释 二抗1：1000 羊抗兔IgG-HRP或者羊抗小鼠IgG-HRP 置于摇床上，60次/ min，室温孵育1-2h。PBST(TBST)洗涤5min×10次 8）底物显色 显影液immobilon western 1:1配制，一张5.2×8.3cm膜共用400l。将显影液

12、均匀涂于膜上，把膜盖上1min后曝光 已曝光的膜进行洗脱 1×TBST洗两遍，每次5min 洗脱液洗一遍，20min 1×TBST洗两遍，每次5min 牛奶封闭1h以上，封闭非特异性表位 Western blot常见问题分析 (一) SDS-PAGE电泳 1.胶不平？凝胶漏液？ . 胶板洗刷干净 . 加入AP和TEMED的量要合适 . 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 . 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 . 两块玻璃板底部要对齐 2.条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？ . 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 . 拔梳子要迅速，清

13、洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 . 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 . 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 （二）转膜及抗体检测 1.凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？ . 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min . 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 . 确保膜和胶块之间没有气泡 . 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 2.转移到膜上的蛋白很少？ . 蛋白分子量< 10KD . 蛋白的等电点< 9 . SDS浓度不合适 . 凝胶太厚 对策： . 蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 . 更换高pH值Buffer . 在阴极buffer中加入0.005 0.01% SDS 可提高转膜效率 . 延长转膜时间 3.背景太高？ . 膜没有均匀浸湿 . 膜或者缓冲液污染 . 封闭不充分 . 抗体与封闭剂出现交叉反应 . 抗体浓度过高 对策： .转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 . 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 . 检测一抗、二抗与封闭剂是否