a mouse is not a cow

1、A mouse is not acow在胚胎发育过程中早期细胞分化事件在小鼠与牛之间存在不同，应该重新研究哺乳动物间发育的差异性，但不影响小鼠作为模式动物的广泛应用。细胞分化的时间以及分子机制对于牛和小鼠是不同的(Development Cell, Berg et al)。多能性，即细胞具有分化形成所有体细胞类型的能力。哺乳动物囊胚的内细胞团(ICM)具有细胞的全能性，这与转录因子Oct4的表达与功能密切相关。滋养外胚层细胞形成胎盘组织，表达大量的谱系限制性转录因子，Cdx2较显著。缺失oct4或cdx2基因的小鼠胚胎能够形成正常的囊胚。oct4突变体囊胚的内细胞团细胞的全能性降低2，并且表达

2、滋养外胚层标记基因；而cdx2突变体囊胚的外部细胞能够表达多能性标记基因，例如oct4的异位表达，但滋养层谱系不能够进一步进行分化（3）。这一现象表明了一种模式，即限制性的表达Oct4和cdx2会相互抑制由各自引起的向不同方向的细胞分化并决定细胞的命运。Berg（1）等提出这种模式是否适用于牛的细胞命运决定。Berg等研究发现，与小鼠不同的是在牛早期囊胚发育阶段Oct4并不只局限在ICM中表达。在囊胚形成的初期Oct4与Cdx2在滋养外胚层中共表达一段时间。这一发现与之前的报道一致，在猪和人胚胎中也得到了一致的结果。在小鼠中，在胚胎发育的卵裂后期以及早期胚胎阶段Oct4与Cdx2一直是共表达的

3、，直到孵化囊胚时期才局限表达于ICM中。所以为什么Oct4在牛的滋养外胚层中表达的时间较在小鼠中长呢？Berg等人利用小鼠Oct4绿色荧光转基因的牛胚胎研究发现，在牛囊胚中不存在使Oct4局限表达在ICM的功能性因子（图1a）。Cdx2可能会发挥限制性作用，但是研究者证实Cdx2蛋白只在牛胚胎发育后期才发挥作用。然而，Berg等人并没有继续研究Cdx2对于Oct4的限制表达作用在牛胚胎中是否延期了，也没有证实在敲碱Cdx2后，在胚胎发育过程中Oct4是否会异位表达。研究显示（1），利用包含牛Oct4调控元件的小鼠Oct4绿色荧光转基因小鼠胚胎和牛胚胎发现，在小鼠以及牛的ICM和TE中都有Oct

4、4的表达（图1b）。这表明在牛胚胎中，Cdx2并不是影响Oct4表达下调时机的唯一因素。同时也表明牛调控元件对小鼠囊胚中调控Oct4表达下调的因子没有反应。在Oct4调控元件的四个进化上保守的区域中，CR4是牛和小鼠之间序列差别最大的一个，Berg等人用牛的CR4代替了小鼠Oct4调控区域的CR4，结果显示Oct4不局限表达在ICM，这与牛的Oct4调控元件的作用相同。不同的DN和调控区域以及不同的结合因子对Oct4在小鼠和牛囊胚中的表达具有不同的调控作用。如果能在转基因小鼠中检测人Oct4基因的调控元件会更类似于小鼠还是牛的序列，这将是一有趣的研究。尽管与其他家畜动物一样，Oct4在人囊胚滋

5、养外胚层的表达时间较小鼠中长，但Cdx2和Oct4共表达的时间只比小鼠中略长。在胚胎着床前6天，Oct4只在人胚胎的ICM中表达。但是，为什么在不同的哺乳动物囊胚中存在不同的调控方式呢？胎盘的出现是生物进化中较先进的一次进化事件。哺乳动物物种间其滋胚层以及胎盘的形态存在巨大的差异性，其中包括近来胎盘特异基因家族的进化分歧。例如，在小鼠胚胎在发育的第5天着床；人的胚胎较大， 7-9天后着床，并且伴随高度侵袭性的滋养层细胞生长；牛、猪以及羊的囊胚悬浮生长在子宫内，直到2-3周后着床。Berg等提出胚胎着床时间的不同导致小鼠中滋养层细胞的分化比牛中要早，他们将牛胚胎不同发育阶段的滋养层细胞与胚胎混合

6、制备了嵌合囊胚，实验结果支持了这种假设。更显著的是，他们将嵌合的牛囊胚移植到受体牛中并使其后期正常发育，表明早期的滋养层细胞能够促进发育过程中ICM衍生物的形成。这项研究的意义在于强调对于不同哺乳动物包括人的囊胚中功能性谱系限制的时机及其分子机制的探究的重要性。这些参数的不同很可能就是分离获得多种哺乳类物种的多能性干细胞以及滋养层干细胞的困难所在。尽管在一些家养类物种包括牛中，利用成纤维细胞进行重编程诱导出多能性干细胞，但这些细胞系的多能性一般都依赖于外源重编程因子的持续表达。所以对这些物种的多能性的控制，我们对此需要一个更好的理解。鉴于对小鼠胚胎发育的详细了解，我们更应探索人以及其他物种的胚

7、胎发育的相似以及不同之处，这有助于进一步了解哺乳动物胚胎的差异性。Trophectoderm Lineage Determination in Cattle摘要小鼠胚胎囊胚后期分化形成滋养外胚层（TE）和内细胞团(ICM)，分别表达CDX2和OCT4蛋白。在牛中TE形成的时间与小鼠不同，Cdx2对TE的维持作用比小鼠中稍晚一些，并且没有抑制TE中OCT4的表达。在小鼠的TE中小鼠Oct4报告基因（mOct4）得到抑制，而在牛的TE中保持活性。mOct4报告基因中具有Tcfap2结合位点，能够介导Cdx2对于Oct4表达的独立的抑制作用，而在牛、人以及兔中的Oct4基因没有此结合位点，使得在滋胚

8、层中Oct4表现出高水平表达。我们的数据重新定义了小鼠中ICMTE形成的调控网络，证实了小鼠胚胎发育过程中滋胚层细胞的快速分化以及早期胚胎着床的现象。这些结果重在强调小鼠不能作为研究哺乳动物早期发育阶段以及干细胞生物学的代表（模型）。前言哺乳动物胚胎发育的显著特征是早期胚胎发育过程中滋养外胚层的形成。滋胚层形成胚外结构胎盘，依靠胎盘从母体获得营养物质供子宫中胎儿发育，当胎儿出生后胎盘弃掉。小鼠胚胎在32细胞时期，将来形成滋胚层的外部细胞和将来形成内细胞团的内部细胞的相对位置已经确定（Dyce et al，1987）。但这两类细胞系的建立是在发育的较后时期发生的。有很多研究发现在扩展囊胚期（约6

9、4细胞期），ICM细胞已经失去了形成TE的能力（Balakier Pedersen）。Spindle等人发现TE细胞比ICM细胞的命运决定要早，并且最近有研究证实在早期胚胎囊胚腔形成时就决定了细胞的分化方向（Suwinska et al.，2008）。小鼠胚胎中，参与TE形成的因子包括具有同源结构域的转录因子Cdx2和Oct4（Pou5f1）。在囊胚晚期，CDX2蛋白局限表达于TE中，而OCT4蛋白只在ICM中表达（Dietrich）。在8细胞时期左右，两种蛋白在TE和ICM中都表达。共四组数据证明在TE的形成过程中需要CDX2的表达。第一，在32细胞时期囊胚腔形成后，CDX2蛋白局限表达于外

10、部细胞，对TE细胞系的建立具有协同作用（Dietrich）。第二，抑制Cdx2后，能够形成早期囊胚，但由于滋养外胚层上皮细胞失去了完整性，导致胚胎不能形成囊胚腔，TE细胞出现凋亡，胚胎不能成功着床（Strumpf）。第三，从正常的小鼠胚胎能够分离得到滋养层干细胞，并能分化形成胎盘谱系（Tanaka），而Cdx2突变的胚胎不能成功分离获得具有分化能力的滋养层干细胞（Strumpf）。第四，通过胚胎干细胞的研究同样证实Cdx2对于维持TE细胞系的作用。ES细胞在体内和体外可以分化形成除TE细胞外的所有细胞系，因此是内细胞团在体外的副本。虽然通过抑制敲除Cdx2基因的ES细胞中多能性因子Oct4的表

11、达，能够诱导ES细胞分化形成滋胚层细胞系，但只有胚胎表达Cdx2时才能成功分离获得能够自我更新的TS（滋养层干细胞）样细胞（Niwa et al.,2005）。这四部分实验清晰地指出Cdx2在TE细胞系形成过程中的作用，同时也说明了Cdx2在TE细胞系形成的初期不是必需的。Ralston等利用Cdx2缺失的和野生型的2细胞时期的卵裂球进行嵌合体实验进一步证实了此观点。Cdx2突变的细胞能够形成TE而不是ICM。？那么Oct4在TE形成过程中的作用是什么呢？小鼠囊胚晚期，正常情况下Oct4在TE中表达下调，Oct4对于ICM的形成是必须的，而对于TE的形成是相互排斥的。Cdx2突变体胚胎不存在T

12、E特异性的Oct4表达下调，并且其TE的形成受损（Ralston and Rossant，2008；Strumpf）。此外，在ES细胞中下调Oct4的表达或过表达Cdx2可以引起ES细胞向TE细胞方向的分化（Niwa et al.）。这说明Oct4的持续表达会阻止TE的形成，并且Cdx2的重要功能在于通过下调Oct4的表达来维持TE细胞系的稳定。Cdx2直接作用于Oct4远端增强子的自动调节元件从而抑制其转录，使得 Oct4表达下调（Niwa）。对于其它的哺乳动物，尽管很多研究检测标记基因的表达，但与小鼠相比，对于其早期胚胎发育的谱系决定还知之甚少。尽管Kurosaka等人只在牛的ICM中发现

13、了Oct4转录本，但研究发现在人、牛、猪以及兔中，Oct4蛋白直到扩展囊胚期都不局限表达于ICM中（Cauffman，Chen，Hall;Kirchhof；Kobolak et al；van Eijk）。在发育的后期，Oct4转录本以及Oct4蛋白局限表达于外胚层（Degrelle；Hall；Vejlsted），但在猪中的研究结果显示是相反的（Keefer）关于滋胚层标记物，Degrelle等人发现在人和牛的囊胚中都能够转录cdx2，但不能做到定位或定量。在猪和牛的囊胚中，Cdx2蛋白局限表达于TE中（Kuijk）。据此可以推测小鼠和其他哺乳动物之间标记基因表达的潜在差异。牛在受精4天后16细

14、胞期时第一次能够分辨出胚胎细胞卵裂球的相对位置，包括内部细胞和外层细胞。在体内，第6天囊胚形成，约有100个细胞左右；第7天扩展，第8天形成孵化囊胚（Van Soom）。体外培养体系中，7天内胚胎保持正常发育，与体内发育相比，提前一天出现形态界线（Van Soom）。第8天，ICM分化形成上胚层和下胚层（原始内胚层）。2天后，下胚层完全嵌入TE的内表面（Maddox-Hyttel）。大约胚胎发育到12天时，滋养层上覆（Rauber layer）消失，此时的上胚层被称为胚盘。在第14天形成原肠胚和中胚层。本实验中把牛作为研究对象，首先，定量研究那些在小鼠中对谱系决定具有重要作用的因子在牛中的表达

15、水平；其次，探求存在差异的原因；第三从功能上验证这些因子的作用；最后检测牛扩展囊胚时期的滋养外胚层是否是分化的。讨论小鼠早期胚胎发育到桑椹胚阶段，Hippo信号通路的激活对于TE的形成具有决定性的作用（Nishioka et al.;Yagi et al），Hippo信号通路通过激活Tead4转录因子，作用于多能性的卵裂球，从而建立TE细胞系。鉴于在牛桑椹胚阶段检测到Tead4RNA，我们推测这种分子机制可能是保守的，在牛中同样存在。牛和小鼠胚胎发育到早期囊胚阶段，胚胎具有两种形态上不同的细胞集落，分别是ICM和TE，并且两类细胞的分化方向不同。当小鼠胚胎发育到囊胚中期时，ICM和TE这两种细

16、胞的命运已经定型，因此这种细胞形态上的差异具有功能上的意义。然而，牛扩展囊胚晚期的TE细胞的命运还没有完全被确定。细胞系的定型需要建立一个自我执行的转录网络，使其具有自身的谱系特征并阻止其向其它方向分化。Cdx2、Eomes、Tcfap2c、Elf5、Ets2、Sox2和Gata3是小鼠中早期维持滋胚层谱系的关键转录因子，通过研究发现，当缺失这些转录因子时会阻碍TE细胞的增殖并不能分离获得滋胚层干细胞（Avilion。）。本实验证实Cdx2对于牛滋胚层谱系的维持也是非常重要的。由于在牛和小鼠中，滋胚层的形成都是先于谱系决定的，所以对于维持滋胚层特性并分化的网络体系还不够清楚。滋胚层网络体系也必

17、须阻止早期具有ICM特性的卵裂球向其它方向的发育。Oct4、Nanog、Sox2是多能性网络的核心基因（Boyer）。这些基因在促进彼此基因表达的同时会抑制参与其它谱系包括滋养外胚层的形成的基因的表达。例如，在ES细胞中Oct4结合在上游启动子和Cdx2的内含子1区域，使得Cdx2的表达下调（Loh et al；Niwa et al）。通过过表达包括Oct4在内的转录因子能够将分化的细胞诱导成类似ES样细胞（iPS）（Takahashi）。相反地，通过抑制ES细胞中Oct4的表达会引起ES细胞向滋胚层方向的分化。（Niwa）由于ICM和TE在发育过程中存在密切的联系，并且在桑椹胚阶段具有共同的

18、Oct4表达的前体物质，因此两种细胞系之间的这种转换是正常的。因此下调Oct4的表达对于TE自身网络的维持是必须的，而且Oct4表达下调的时间以及方式在不同的哺乳动物中表现不同。Cdx2作为关键的滋胚层转录因子，已被证实是唯一能直接干扰Oct4活性的重要的转录因子。Cdx2在Oct4远端增强子的4号保守区干扰Oct4的自调节性进而抑制其转录（Niwa）。Cdx2与Oct4结合后会潜在影响上百个Oct4的靶基因的转录，导致抑制作用更加广泛。显著的是，在牛囊胚晚期，尽管在TE中Cdx2的mRNA以及蛋白的含量较高，但TE中Oct4的表达量依然较高。此外，降低牛TE中內源Cdx2的表达并不会上调Oc

19、t4的表达，这表明在牛囊胚晚期Oct4的表达没有受到Cdx2的显著抑制。缺乏抑制原因可能是由于Cdx2和Oct4的比率在牛与小鼠中存在显著的差异。牛囊胚晚期Cdx2：Oct4mRNA比小鼠中低了将近十倍，单独分析TE中的比率差异性更加显著。在牛胚胎发育到第9天，即出现上胚层并且下胚层将要充斥整个囊胚腔时，Cdx2在TE中的表达量才开始超过Oct4的表达量。而在小鼠中，当胚胎发育到64细胞囊胚晚期时，Cdx2和Oct4几乎已经分别局限表达于TE和ICM中。为什么Cdx2：Oct4的比率这么重要呢？根据Niwa的报道称Cdx2与Oct4的比率会彼此抑制两种蛋白的活性。因此，牛中Oct4的高表达会抑

20、制Cdx2的活性，阻碍了Cdx2对Oct4的下调作用。在本实验中同样出现了此现象，利用转小鼠Oct4绿荧光基因的牛研究发现，虽然转基因中含有抑制Oct4的调控区域，但在转基因牛的TE中仍保持Oct4活性。如果在牛和小鼠的TE中存在的唯一不同是Cdx2与Oct4的比率，那么将牛的Oct4绿荧光报告基因转入小鼠后，在小鼠TE中应该不会有转基因Oct4的表达。我们推测小鼠中至少存在两种不同的机制来抑制TE中Oct4的功能，其中包括Cdx2和AP2蛋白，都是通过影响Oct4的转录实现的。Cdx2通过直接的相互作用影响Oct4蛋白的活性，相比而言对Oct4的抑制可能更有效。Cdx2突变体胚胎要比AP2缺失的胚胎的表现更严重，进一步说明Cdx2的作用较显著。此外，转小鼠Oct4绿色荧光基因牛，由于Oct4在TE中的高表达量抵消了Cdx2的抑制作用，说明AP2蛋白并不足以下调Oct4的表达。重点是，牛囊胚TE中由于O