大学生物化学课件 基因工程

1、1、基因重组：指不同来源的dna在细胞内重新进行组合，并能进行复制、转录、翻译的过程。2、基因工程：在体外用人工的方法进行基因的重新组合，再把重组基因导入到细胞或细菌内进行复制、转录、翻译的技术。无目的-自然界的基因转移和重组 自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。有目的-基因工程第一节第一节 dnadna的转移和重组的转移和重组 （dna transfer snf recombination)dna transfer snf recombination)dna重组包括： 同源重组（homologous recombination) 特异位点

2、重组（site-specific recombination) 转座重组（transpositional recombination)二、位点特异性重组（二、位点特异性重组（site - specific site - specific recombinationrecombination）由由整合酶整合酶催化，在两个催化，在两个dnadna序列的序列的特异位点特异位点间发生的整合称。间发生的整合称。 此过程往往发生在一个特定的短的（此过程往往发生在一个特定的短的（2020200bp ) dna200bp ) dna序列内（重组位点），并且有特序列内（重组位点），并且有特异的酶和辅助因子对其识

3、别和作用。异的酶和辅助因子对其识别和作用。 保守性转座保守性转座：插入序列从原位迁至新位：插入序列从原位迁至新位. .复制性转座复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁至：插入序列复制后，其中一个复制本迁至新位，另一个保留在原位新位，另一个保留在原位. .（二）转座子（二）转座子(transposons)(transposons)转座转座 可从一个染色体可从一个染色体位点位点转移至另一转移至另一位点位点的分散的分散的重复序列，即一段可以发生转座的的重复序列，即一段可以发生转座的dnadna。 组成：侧翼为两个分离的组成：侧翼为两个分离的反向重复序列反向重复序列； 转座酶基因转座酶基因； 抗

4、生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因。基因工程（基因工程（genetic engineeringgenetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组dna技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为（称之为 克隆克隆 ）和行使正常功能（称之为）和行使正常功能（称之为 表表达达 ），从而创造生物新品种或新物种的遗传学），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。技术。： 来自同一始祖的来自同一始祖的（copycopy）的）的集合。集合。完整完整d

5、nadna克隆过程包括：克隆过程包括： 目的基因获取；目的基因获取； 基因载体选择、构建；基因载体选择、构建； 目的基因与载体拼接；目的基因与载体拼接； 重组重组dnadna分子导入受分子导入受体细胞；体细胞； 筛选重组体筛选重组体 目的基因的表达。目的基因的表达。重组重组dna dna 技术技术 （recombinant dnarecombinant dna） 又称基又称基因克隆（因克隆（gene cloninggene cloning）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, re)(restriction endonuclease, re)定义

6、定义识别识别dnadna的特异序列的特异序列, , 并在识别位点或其周围并在识别位点或其周围切割切割双链双链dnadna的一类内切酶。的一类内切酶。ggatccggatcccctaggcctaggg gcctagcctaggatccgatcc g gbam bam hh切割切割dnadna后产生含后产生含5 5磷酸和磷酸和3 3羟基的末端羟基的末端类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)(palindrome) 切口切口 ：平端切口：平端切口、粘端切口粘端切口gtccaghindgtcgaccagctggacctg平端切口平端切口bam hgcctaggatc

7、c gggatcccctagg粘端切口粘端切口异源同功酶，同裂酶异源同功酶，同裂酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点同一位点，这些酶称同功异源酶。，这些酶称同功异源酶。ggatccggatcccctaggcctaggg gcctagcctaggatccgatcc g gbam bam hhggatccggatcccctaggcctaggg gcctagcctaggatccgatcc g gbstbst同尾酶同尾酶酶不同酶不同、识别序列不同识别序列不同，但切割，但切割dnadna后，后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相

8、同的粘性末端称为配伍未端这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)(compatible end)。 ggatcc ggatcc cctagg cctagg agatctagatct tctaga tctagag gcctagcctag gatcc gatcc g ga atctagtctag gatctgatct a a酶不同酶不同、识别序列识别序列相同相同，产生相同的粘，产生相同的粘性末端，称为性末端，称为同功异同功异源酶。源酶。酶不同酶不同、识别序列识别序列不同不同，产生相同的粘，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。性末端，称为同尾酶。克隆载体克隆载体(cloning

9、vector)为使插入的外源为使插入的外源dna序列被序列被扩增扩增而特意而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源dna序列可序列可转录翻译成转录翻译成蛋白质蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准：载体的选择标准：4361bp4361bp 目的基因，又称目的目的基因，又称目的dnadnacdnacdna基因组基因组dnadna外源外源dna（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 1.粘性末端连接粘性末端连接 同一限制酶的酶切同一限制酶的酶

10、切: 重组子、载体自连、目的基因自连重组子、载体自连、目的基因自连 不同限制酶的酶切：不同限制酶的酶切： 重组子重组子目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶t4 dna连接酶连接酶15c重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录同一限制酶的酶切：同一限制酶的酶切：两个不同限制酶的酶切两个不同限制酶的酶切 ： 使目的使目的dna按正确的方向插入按正确的方向插入受体菌条件受体菌条件安全宿主菌，由大肠杆菌安全宿主菌，由大肠杆菌k12改造，改造，在人的肠道几乎不能存活。在人的肠道几乎不能存活。 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感

11、受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (质粒质粒dna分子导入细菌的过程）分子导入细菌的过程）转染转染 (噬菌体、病毒携带噬菌体、病毒携带dna分子导分子导 入宿主细胞的过程入宿主细胞的过程)（四）重组（四）重组dna导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等四环素抗性基因（tetr）失活( (

12、插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择 互互补补的的检检测测片段片段片段片段片段片段片段片段原原位位杂杂交交重组重组dnadna技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 扩增或表达扩增或表达重组重组dna技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组dna cdna 人工合成人工合成pcr产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体dna目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体