高影响力综述

1、纳米材料毒性测试21世纪：预测性毒理学方法和高通量筛选的使用概论工程纳米材料（ENMs）的生产（能源管理体系）是材料设计和新的消费产品开发的一个科学的突破。纳米技术的成功实施是全球重要的经济增长，但是我们还需要考虑由于可能产生有害生物效果的新的物理化学性质所带来的可能的环境健康和安全（EHS）的影响。为了评估工程纳米材料的风险，需要可靠和可再现的筛选方法，以测试基本材料以及纳米产品。需要一个能够探讨在纳米/生物界潜在无数的生物物理化学间的相互作用的平台，以响应我们已经开发出的一种预测性毒理学方法。我们定义了一个预测毒理学方法，机制基础的使用在体外进行高通量筛选对可能导致在体内病理或者疾病产生的

2、能源管理的物理化学性质进行预测。在体内的结果是用来验证和提高体外高通量筛选（HTS）以及建立允许危险排序和通过一个在体内外测试的适当组合建模的构效关系（SARS）。这个概念与美国国家科学院的具有里程碑意义的2007年的“21世纪毒性试验：远景和战略”报告是一致的，它主张通过从定性的描述动物试验过渡到定量的机械以及使用高通量的方法为基础途径的在人细胞或者细胞系进行毒性试验以增加毒性测试的效率。因此，我们已经实现用高通量筛选方法去筛选组成和组合的工程纳米材料库以开发可用于预测体内损伤结果的危险排序和构效关系。这个预测方法允许在体外进行大量的筛选分析和高容量数据生成，但关键是验证研究在动物或整个生物

3、体内进行是被限制的。人类或环境暴露人群的风险减少可以使我们专注于限制或避免引发这些毒性反应和实施有潜在危险的工程纳米材料更安全设计的风险。在这个报告中，我们通过组成工程纳米材料库，高通量筛选检测基础机理，危险等级和纳米构效关系发展的使用回顾了建立预测毒性学模式以评估吸入物和环境毒理学方案所要求的工具。我们将讨论已经出现的基于特定工程纳米材料属性的主要损伤模式以及描述基于溶解化学表征为毒性的主要预测因子的纳米氧化锌的安全设计。介绍有相当多的争论是关于如何继续进行工程纳米材料毒性测试，与围绕毒理学的端点去评估的主要讨论点，筛选工作的严谨性，体外（细胞和分子）与体内（动物或整个有机体）测试的正确平衡

4、，工作的成本，以及谁应该为监督纳米环境健康和安全管理负责。因此，需要一个平台来研究在纳米/生物界潜在的巨大的生物物理化学间的相互作用，这个由加州大学纳米技术环境影响中心（UC CEIN）以及加州大学洛杉矶分校纳米生物学和预测毒理学中心（UCLA CNPT）实施的方法是用于分别评估可预测的环境和肺潜在危害分子与细胞损伤机制。通过高通量筛选途径发张预测毒理学的关键成分在缺乏用于纳米安全分析的标准参考材料的情况下，我们实现了我们自己的内部合成和获得成分和组合工程纳米材料库高数据生成的内容。化学成分很重要,因为它决定了表面化学、表面能、氧化还原状态,光活化的潜力,表面缺陷、电荷和定义“表面反应性”的表

5、面基团。材料化学和表面涂层也确定润湿性,悬浮稳定性、溶解性、有毒离子脱落和持久性危害产生的关键影响因素。尽管纳米尺寸和相应的增加表面积有助于表面反应活性，其他物理化学性质（如尺寸、形状、聚集状态,晶体结构，表面电荷和表面涂层）是表面反应活性和组成的重要调节因素。因此，工程纳米材料的毒性可以归因于相对的非特异性生物反应和材料的大小、形状和生物持久性，但也可能是由发生在一个反应表面、配体或者影响特定毒理学途径的有毒离子的释放的特殊生物相互作用造成的。鉴于这种复杂性，我们已经获得了具有良好表征的组合库，其中包括金属、金属氧化物（MOx）、碳素纳米管（CNTs）以及不同的二氧化硅以获得可用于高通量筛选

6、、危害等级和动物验证研究的机械信息。此外，由通过不同材料组成对潜在危害属性的识别，我们还介绍了工程纳米材料组合库中被系统地改变成调查定量构效关系的特有的属性。为了完成具有良好表征的纳米材料库的第一关键成分，我们最初人工合成了一个二氧化钛、二氧化铈和纳米氧化锌的物理化学性质在单参数毒理学筛选的成就向细胞毒性、氧自由基的产生或者细胞炎症反应看齐之前就被严格表征的小型金属氧化物库。总的来说，这些试验证明了在哺乳动物细胞中，维持高水平毒性的是氧化锌而不是二氧化钛和二氧化铈。这种毒性是由于纳米氧化锌的溶解导致有毒的Zn2+的释放、产生活性氧类（ROS）的能力、线粒体的扰动、白介素-8、白介素-6、脑瘤坏

7、死因子的产生和细胞毒性的诱发造成的。这些细胞损伤反应被概括为纳米氧化锌在啮齿动物的肺部的急性氧化和炎症作用。此外，金属烟热、焊工职业病的发展期间也是在人群中引发同样损伤的途径。在氧化应激作用的参与的基础上，作为一个工程纳米材料毒性的关键机制，我们进行了一种多参数的高通量筛选试验来监测金属氧化物的致死和亚致死的氧化应激反应。这种将在后面进行更详细讨论的试验允许我们增加可筛选物质的数量，包括产生活性氧类继发传入神经损伤机制材料的毒理学评估的性能。也允许我们为金属和金属氧化物纳米粒子建立纳米构效关系以及对组合库的介绍以评估颗粒尺寸、溶解度、形状、长宽比和物质的孔隙率。类似的方法被应用于建立一种用于纤

8、维化作用的多壁碳纳米管（MWCNTs）的预测毒理学范式，从材料（如购买的）着手，然后导入纯化的羧基官能化管。我们还开发了组成和基本属性库以研究二氧化硅和纳米银的毒性。二氧化硅的工程纳米材料危害是由教授Brinker 和Zink在这个特殊版本中的一个独立贡献中讨论的。对于预测毒理学方法的第二个基础建设要求是合理的高通量筛选方法的开发以定量评估在体内预测的不良后果的剂量和时间依赖细胞损伤反应。生物、医学、药学和毒理学的研究已经表明一个系统生物方法是如何可以用于高通量筛选的。虽然对有毒物质（如化学品）风险评估的现有方法非常依赖于在动物模型中极端不利于健康的影响，一个不良健康后果的说明并不会为预测毒理

9、学建模的性能提供一个坚决基于科学的平台。虽然这是合理的，新的筛选模式在可以用于高通量筛选开发之前能够通过蛋白质组学或者基础基因组和基础途径方法被发现。目前最快速的平台是可链接到疾病的发病机理的机械细胞损伤反应的应用。这些毒理学途径的定量评估允许高通量筛选用于体内预测决策，从而限制动物作为主要测试平台来使用。虽然在体外到体内相比较的预测潜力仍然处于起步阶段，大量的细胞损伤反应机制已经成形，这可以定量实施以评估危险性工程纳米材料属性。一些毒理学机制让我们为毒理学建模建立我们第一代纳米构效关系。虽然到目前为止大部分纳米构效关系都是基于已知的毒理学途径，诸如蛋白质组学和基因组学的发现平台将很可能会在未

10、来提供新的筛选模式。第三个要考虑的关键因素即机械损伤途径的使用，其中一个最好的已经在我们的研究中发现的高通量筛选例子是筛选生物活性氧类产品和对金属氧化物纳米粒子、电子/空穴对代、表面缺陷、化学溶解和释放有毒金属离子等能带的氧化应激反应。我们用一种兼容荧光染料混合物去开发一种筛选细胞中致死和亚致死氧化损伤反应的功能接系列的荧光显微基础方法。这种由384孔板机械处理进行的多参数高通量筛选检测同时细胞总数和细胞核的大小、线粒体膜电位、细胞内钙离子通量和衰亡细胞膜通透性增加进行评定。这些细胞反应之间的功能联系表明检测还能够评估那些表面膜损伤或者细胞器损伤比产生活性氧类更重要的工程纳米材料。虽然在单个参

11、数分析中可以获得类似的风险等级（例如MTS、LDT释放或细胞ATP含量），大批量、与时间相关的高通量筛选数据集使我们可以开发能够建立纳米构效关系的机器学习及风险等级工具。除了氧化应激，其他损伤机制出现在高通量筛选，包括长宽比材料炎性体激活、细胞因子和趋化因子的生产、光活化、膜损伤（针对阳离子或活性材料表面）、促纤维化反应、报道基因通过氧化应激信号通路或者DNA损伤的转录激活、孵化酶的抑制作用和斑马鱼胚胎的转基因热休克蛋白的表达。上述的所有反应可以通过例如荧光显微镜、发光基础记录基因活性、膜溶解检测复用因子检测、明场显微镜读出程序发展成自动化的高通量筛选。除了哺乳动物细胞的筛选，我们也实现了在鱼

12、鳃细胞系、细菌、酵母和整个有机体系的高通量筛选。斑马鱼筛选平台将在稍后讨论。预测模式的第四个要求是包括在硅片工具进行数据分析、数据转换、机器学习和高通量筛选数据建模的数据分析框架的开发。因为这个专业领域会由Cohen和Rallo教授在一个随身手稿中处理，可以这么说，应为高通量筛选数据时高维的，我们为了视觉上的演绎，用降维（或提取）的方法把数据投影到低维特征空间。一个直观的方法是聚集分析以提取相似模式和根据同源的生物反应或者与理化性质的联系进行工程纳米材料归类。热映射聚类在高通量筛选数据分析中非常重要。热映射提供便于识别大数据集的相似模式数据的有序表达。有一种互补的方法是使用能够在空间投影保持在

13、原特征空间的距离测量的拓扑功能方法。自组织映射（SOM）算法为数据转换提供了一种有价值的计算工具。与热映射相比，自组织映射的预测通过拓扑地提供输入空间的有序表达促进发现可变因素之间的嵌入关系。数据的聚类可以通过显示聚类中心（距离矩阵）之间的距离或者通过投影特征到不同的使其参数更详细评价的平面组件在自组织映射网格上实现可视化。构效关系已被定义为一个化学品的结构或性质及其生物活性相关的统计模型。相对于构效关系可以根据理化性质和毒理学庞大数据库的有效性发展的化学世界，纳米构效关系的发展需要一个不同的更要求需要考虑工程纳米材料的三维结构的庞大数据库的方法。我们的高通量筛选检测现在在一个多元的情况下（例

14、如浓度、曝光时间以及亚致死和致死的生物反应）提供的数据，使我们能够开发大多都是依赖于纳米颗粒的物理化学性质的第一代纳米构效关系。利用预测毒理学了解工程纳米材料对肺部的伤害吸入毒理学是由于有毒烟雾、气体、颗粒和纤维的吸入造成的肺部损伤的研究。肺是遵循在工程纳米材料的合成和处理期间烟雾化的职业暴露中的一个很重要的靶器官。在肺部的工程纳米材料毒性研究在特别具有挑战性的角度来看在模拟现实生活的吸入暴露是困难和昂贵的。尽管有证据证明,对于纳米ZnO和石英颗粒附带的职业暴露可分别在人类中引起金属烟热和肺纤维化，我们对如何执行一个工程纳米材料的大系列肺部危害等级没有一个全面的了解。此外，为每个新材料进行雾化

15、吸入的劳动强度和高成本在逻辑上市不可行的。因此，吸入毒理学可以从预测毒理学中受益，为此我们提出两种方案。第一个例子是被广泛应用于化妆品、防晒剂、催化剂、纺织品和太阳能电池的一种金属纳米粒子预测模式的发展。许多这些材料产生的粉末是可吸入和在溶解状态由于氧化还原活性或者有毒的金属离子流造成危险而为人所知的。在三种金属氧化物纳米粒子的初步探索中，纳米ZnO因其由于也能在支气管上皮细胞和巨噬细胞产生的的细胞因子和趋化因子一个特征系列的溶解和诱发产生强烈肺部炎症的能力而于纳米TiO2 和纳米CeO2相距甚远。从机械角度看，细胞内Zn2+的释放诱导氧化应激反应，这是多参数分析的基础。肺部以及全身溶解氧化锌

16、颗粒的氧化应激诱导可以通过使用血红素加氧酶-1（HO-1）基因启动子的转基因表达连接到荧光素酶报告在活体小鼠中成像。除了相对较少的金属氧化物，大多数材料的肺部潜在危害还没有被系统地探讨。介绍了多参数高通量筛选测定之后，现在就是有可能为体内危害排名和预测决策发展构效关系的时候。作为一个例子，我们使用了逻辑回归模型来开发一种评估九种基于多参数数据的毒性或无毒性的金属氧化物纳米粒子的纳米构效关系能力，因此，在支气管上皮细胞浓度为0.375-200g/mL的氧化铝、二氧化硅、四氧化三铁、氧化铈、四氧化三钴、二氧化钛、氧化锌、氧化铜以及三氧化钨的纳米颗粒的筛选,每7小时和24小时，根据14种材料反应描述

17、中的4种达到100%分类精度建立一个决策。根据这种分类，以分离金属氧化物的原子（雾化能力）的焓，金属的元素周期表的号码，纳米颗粒的体积（在溶液中）和一次粒径被认为是准确的描述粒子的产生有毒的氧化应激能力。诱导金属氧化物的氧化应激预测在肺部有发色炎症的潜力。最近，有人提出这样一个概念框架，金属氧化物的传导（Ec）和价带能量（Ev）可以是发展一个解释了当这些粒子接触到细胞时氧化应激反应的产生的理论框架。一种可能是，随着细胞生物氧化还原电位的Ec和Ev的重叠可以构成电子转移，这预示着金属氧化物的氧化应激潜力。通过一系列保持电位在-4.12到-4.84Ev的氧化还原对使细胞的氧化还原电位在稳态调节下。

18、氧化或还原性物质可以通过增加活性氧的产生和/或减少抗氧化水平干扰这种氧化还原平衡。即刻响应触发一层Nrf2介导的在氧化应激的最低级别（1级）恢复氧化还原失衡的抗氧化防御层。如果这种防御失败，氧化应激的升级可以转移激活促炎症信号转导通路的细胞反应（2级）或线粒体介导的细胞毒性（3级）。我们假设带隙能量对生物氧化还原电位为预测金属氧化物潜在危害构成一个参数的关系，在这个基础上，我们开发了一种为金属氧化物用细胞氧化还原电位提出理论的重叠和实验测定Ec和Ev值的纳米构效关系。在最初用24中金属氧化物纳米粒子的建模练习，我们已经能够表明，5/7种颗粒显示带隙重叠，这是它们在多参数检测产生有毒氧化应激能力

19、的一个准确预测。此外，我们的初步结果表明，有带隙重叠和产生氧化应激能力的材料（例如Co3O4、Cr2O3、Mn2O3、CoO）相比于那些不显示带隙重叠的材料也会诱导高水平的肺部急性炎症。我们预计，这将导致将使我们把金属氧化物纳米颗粒分类成低级的、中级的或者高级的肺部潜在毒性的纳米构效关系。然而，我们需要说明的是，为什么具有带隙重叠但没有高通量筛选毒性TiO2以及不显示带隙重叠但现实毒性的ZnO不遵循基准假设。它可能需要引入溶剂化能和光活化动力以制定一个更完整的画面。他为毒理学研究的第二个预测毒理学范式是开发了多壁碳纳米管（MWCNTs）。一些管特性通过单壁和多壁碳纳米管确定慢性肉芽肿性炎症的诱

20、导、纤维化、细胞毒性、遗传毒性和肺部的氧化应激。这包括诸如管或烟囱的长度、疏水性团聚状态、金属杂质、耐久性和表面化学的性能。总的来说，这些性能是在构效关系发展中值得隔离研究的。在与肺部纤维化可能相关的组织培养细胞中研究促炎反应定量扩散方法的发展一个重大的进展。这种传播是以牛血清白蛋白（BSA）完成和二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）以定量的方式作为替代肺部可扩散多比纳米碳管的衬里流体元件能力。一个定量的扩散指数的发展使我们执行一系列的纳米碳管所导致的预测潜在纤维化和肺部纤维化的细胞分析。我们最近证明，原材料的分散状态（“制备”或者AP）、纯化（PD）和羧基（COOH）的多比纳米碳管在确定TGF-1

21、，PDGF-AA和IL-1在体内外的生产发挥重要的作用。这些生物标志物协同作用在细胞通讯和胶原沉积在肺部。上皮过度到间质细胞和亲纤维表型，在合作和巨噬细胞IL-1的生产的影响下，在各种疾病状态中在胶原沉积中发挥着作用。多壁纳米碳管分散液的作用在影响分散状态和纯化的多壁碳纳米管反应中是最为显著的，这是在水性缓冲液壁亲水的羧基多壁碳纳米管更疏水性和不稳定性的。良好分散的分散状态和纯化的多壁碳纳米管容易采取了上皮细胞和肺泡巨噬细胞（AM）和诱导壁非分散管更加突出的TGF-1和IL-1在体外的产生，以及TGF-1，IL-1和PDGF-AA在体内的产生。在体内和体外之间的的生物标记物的良好的相关性证实了

22、它们用语预测多壁纳米碳管的肺部纤维化潜力的效用。因为IL-1的生产是机械地依赖于NALP3炎性裂解亲的IL-1的组件，这为提供基于疏水性、悬浮液稳定性国家级纯度和碳纳米管的表面功能的毒理学预测的纳米构效关系的高通量发现和发展提出了一个坚固的机械范例。我们的初步数据表明，由BSA加DPPC引起的管扩散增强了细胞摄取和溶酶体损伤，导致炎性激活。溶酶体和炎性之间的联系可以为预测其他包括金属氧化物在内的长宽比材料的肺纤维化潜力构成一个最终共同途径。我们正在为预测碳纳米管、金属氧化物纳米线和银纳米线（进行中）的肺潜在危险性的细胞因子和生长因子开发多重高通量测定。预测毒理学的使用去了解环境的潜在危害虽然纳

23、米技术曾用于环境净化，但一些工程纳米材料可能造成环境的潜在危害。加州大学纳米技术环境影响中心的使命是是开发一个基础广泛的预测科学模型，以了解工程纳米材料的物理化学性质是如何确定材料的扩散到环境、生物蓄积、营养转移和细胞、机体以及生态系统水平中潜在危险后果的催化。根据我们的预测毒理学方法，这种多学科中心利用良好特征成分和组合的工程纳米材料库根据纳米生物界定量的物理生物化学相互作用来研究这些材料的潜在性在细胞、细菌和微生物环境中以接触毒性途径。如果可能的话，我们用高通量方法来为主要工程纳米材料在不同营养水平的淡水、海水和陆地生态系统的影响的制定预测建立构效关系。在硅片的数据转换和决策工具涉及的数据

24、集成提供风险排名、曝光建模风险分析和定量纳米构效关系建设。在鱼类的毒性测试是生态毒理学公认的金标准。在人类已被用于生物化学和分子疾病机制建模的斑马鱼对环境风险评估是一种很有前途的模型，包括工程纳米材料的毒理学评估。由于胚胎的透明度和良好的特征发育阶段，斑马鱼提供了一个发展高内涵筛选的绝佳机会。因此，我们已经开发了一种高通量筛选方法以评估纳米ZnO阴影的干扰。纳米ZnO溶液干扰孵化酶、在被Zn2+结扎的活性中心中包含三个组氨酸的ZHE1。对于不同的金属，这构成一个控制金属蛋白酶分级的亲和力连接系列，顺序如下：Mn(II) < Fe(II) < Co(II) < Ni(II) &

25、lt; Cu(II) > Zn(II)。因此，我们用斑马鱼来开发一种说明金属和金属氧化物纳米颗粒库孵化干扰的预测毒理学范例。初步研究表明，在我们的多参数高通量检测和斑马鱼胚胎的毒理学结果的危险排名之间存在良好的相关性。唯一例外的是纳米Ag，这显然在胚胎比哺乳动物细胞中毒性更大，这表明纳米Ag易感性存在物种差异。此外，在金属氧化物纳米颗粒（例如CuO、ZnO和NiO）的孵化干扰下可以通过二乙三胺五乙酸（DTPA）逆转，这螯合剂并没有扭转纳米Ag的影响。纳米Ag诱导形态学异常（例如心包水肿、弯曲刺和和尾部畸形）的频率高,不能观察过渡金属氧化物。这些数据表明Ag和过渡金属的行动机制是不同的。虽

26、然我们怀疑纳米Ag孵化干扰时继发于发展途径的影响，过渡金属似乎直接靶向ZHE1。我们已经产生重组ZHE1酶用可切割衬底来执行非生物测定法；我们希望以此来建立一个可以用来预测在斑马鱼胚胎中预测金属氧化物毒性的构效关系。在上述材料的毒性筛选中，有必要在解剖显微镜下对每个胚胎执行目视检查。这种方法是劳动密集的，并限制了观察和可以获得的统计分析的数量。因此，我们开发了一种高通量筛选方法，它利用挑选板机器加快在96孔板胚胎放置以增加观测值的数量。此外，我们实现了两个高含量平台进行图像采集，允许数据的追溯分析和评分。首先，这些平台采用亮场图像分析，在胚胎和幼虫中捕捉表型和发育异常的能力。第二，基于荧光的平

27、台，在转基因动物中捕捉报告基因的表达，包括应激反应，如热休克蛋白（HSP）的表达，使用热休克蛋白70启动因子融合到绿色荧光蛋白报告。我们在UC CEIN和UCLA CNPT的合作者还开发了一个允许基于向量描述的图像快速得分的表型识别系统。本技术革新可在一个实验中高达24种金属氧化物进行高通量筛选，我们利用这些数据连同电感耦合等离子质谱（ICP-MS）的分析和ZHE1测定的重组，为基于金属周期性和溶解特性的孵化干扰开发一个纳米构效关系。这一创新将用材料证明毒理效应使材料的综合剂量反应分析和环境暴露水平的能力推断结果。有趣的是，HSP70的诱导：在转基因斑马鱼幼体的表达需要一个纳米CuO和纳米Zn

28、O的日志倍高浓度比阴影干扰剂量。为纳米Ag毒性研究毒性差异，我们引入了虹鳟鱼鳃上皮细胞株（RTW1），对纳米Ag、板材和电线执行的氧化应激反应的比较多参数高通量筛选分析。我们比较的结果得出在斑马鱼胚胎的毒性结果。纳米Ag显然在RT-W1哺乳动物上皮细胞中更具毒性。有趣的是，纳米Ag片在RTW1中执行一个多参数高通量筛选检测时均大大高于秋天和电线的毒性。同样的趋势在斑马鱼胚胎中观察研究胚胎杀伤力和孵化干扰。虽然在细胞和胚胎中的Ag离子脱落和生物利用度可以解释Ag球的效果，纳米片的增加毒性是依赖于细胞和胚胎的直接接触。为了解释Ag纳米片的高表面反应性，高分辨透射电子显微镜（TEM）证实了堆垛层错和板表面的点缺陷存在，这在Ag纳米球上是不存在的。以半胱氨酸作表面涂层可降低表面反应性，减少细胞和胚胎毒性。这项研究表明了晶体缺陷在除了既定的Ag纳米球毒性中Ag离子释放的纳米颗粒中的重要性。体外和体内之间毒性评估的良好相关性说明了鱼细胞系连同斑马鱼胚胎发展的预测环境范例的效用。一种工程纳米材料的预测