蒲公英多糖的分离、纯化及结构的初步分析

1、蒲公英多糖的分离、纯化及结构的初步分析高金波，孙丽娜，滕杨，侯巍gao jin-bo sun li-na teng yang hou wei（黑龙江省教育厅生物药制剂重点实验室，佳木斯大学药学院，佳木斯，154007）（the key laboratory for biological drug of the education department helongjiang .college of phannacy, jiamusiuniversity.hilongjiang jiamusi 154007,china）摘要目的：用超声波协同酶法提取蒲公英根多糖，并对该多糖进行分离、纯化、分级和

2、结 构的初步分析。方法：采用超声波协同酶法进行提取多糖，分离纯化后，经sephadex g-75 柱分成abcd四级，采用优化的pmp柱前衍生hplc法分析单糖组成。采用紫外、红外、 高碘酸氧化等方法进行结构的初步分析，结果：四种单糖均含有d鼠李糖、葡萄糖、d半乳 糖、d木糖和d阿拉伯糖；它们的单糖的摩尔比：a的单糖的摩尔比为： rha：glc：gal：xyl：ara=0.098：2.88：0.125：0.017：0.33 , b 的单糖的摩尔比为：rha：glc：gal：xyl：ara=0.113:0.68:0.13:0.011 ：09, c 的单糖的摩尔比为：rha：glc：gal：xyl

3、：ara =0.139:2.46:0.36:0.13:0.086 , d 的单糖的摩尔比为：rha:glc：gal:xyl：ara =0.028:0.36:0.031:0.012:0.94；结论：四种多糖在结构上有明显的不同。关键词：蒲公英；多糖；结构isolation9purification and analysis of glycoproteinfrom taraxacum polysaccharidesabstract： objective the methods of ultrasonic and coordinated enzyme were used to extract pol

4、ysaccharides from taraxacum roots in order to carry out isolation、purification and preliminary analysis of structure. methods polysaccharides were extracted by ultrasonic and coordinated enzyme methods,after separating and purifying, four levels (abcd) were fractionated by sephadex g-75 column and t

5、hen monosaccharide constituents were analyzed by hplc applied to pmp precolumn derivation. preliminary analysis of structure was analyzed by uv ir and periodic acid method. results four kinds of monosaccharides all contain d- rhamnose > glucose > d-galactose and darabinose. their molar ratios

6、are as follow in turns:fraction a: 0.098:2.8&0.125:0.017:0.33,fraction b: 0.113:0.6&0.13:0.011:0.19,fraction c: 0.139:2.46:0.36:0.13:0.086, fraction d: 0.028:0.36:0.031:0.012:0.94. conclusion it showed that there were significant differences in four species of polysaccharideskey word: taraxa

7、cum ; polysaccharide; structure蒲公英属菊科属多年生的草本植物，乂名黄花地丁、婆婆丁、黄花郎等。现在的研究表 明蒲公英的化学成分不仅有挥发油、黄酮类、三祜类、香豆精类和倍半内酯类，而且富含笛黑龙江省卫生厅（项目编号:2007-510） 醇、棕櫚酸和多糖山。多糖是自然界中含量最丰富的生物聚合物，因其具有能量储存、结构 支持、防御和抗原决定性等多方面的生物学功能，而口有些多糖或其衍生物还具有多种药理 活性，所以近年来多糖成为天然药物研究与开发的一个热点27。所以，本实验对研究较少的 蒲公英根中的多糖进行了结构方面的初步研究。1实验仪器及试剂蒲公英根（河北省安国市京华药

8、业有限公司，由佳木斯大学生药学教研室教授刘娟鉴定为蒲 公英根）；agilent 1100化学工作站（美国agilent公司）；zorbax-c18分析柱（美国agilent公 司）；uv 757型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、三氟乙酸（tfa,纯度鼻 99%）、1 苯基3甲基5毗呻ii林酮（pmp,在使用之前用色谱甲醇重新结晶2次）、葡萄糖（glc, $99%）、d鼠李糖（rha, $99%）、d半乳糖（gal, $99%） d木糖（xyl, 299%）、d- 阿拉伯糖（am, 299%）国药集团化学试剂有限公司；甲醇、乙月青（色谱纯）天津市光复精 细化工研究所；其它实验试剂均为

9、分析纯。2实验方法2.1超声波协同酶法提取、分离及纯化蒲公英根中的多糖蒲公英根一粉碎一石油醸、80%的乙醇冋流脱脂、脱低聚糖->50°c热风干燥一称取适量 的蒲公英根，1:40的料液比，纤维素酶为底物的3%,提取温度为50°c,提取时间为25min, ph=5.0,用超声波法进行提取一提取液浓缩至总体积的l/3-sevage法除去蛋白一大孔吸附 树脂进行脱色一95%的乙醇进行沉淀一低温干燥一蒲公英多糖粗品一用浓度为0.05mol/l nacl溶液溶解一离心一取上清液一定容一sephadex g-75柱层析分步收集苯酚硫酸法检 测一收集反应阳性的高峰部分一体积分数95%

10、的乙醇进行醇析一蒲公英精制多糖a、b、c、 do2.2蒲公英根粗多糖的组成分析2.2.1混合标准单糖的衍生分别精密称取葡萄糖0.0396 g> d半乳糖0.0363 g、d木糖和d阿拉伯糖各0.0300 g、 d鼠李糖0.0364 g,溶于10 ml的氨水中，取该溶液100 pl与100 pl pmp/甲醇溶液（0.5 mol/l） 混合，在70°c下反应30 min,取出后冷却至室温，用1 ml的氯仿萃取，充分振荡后除去有机 相，重复3次。水溶液经0.45 pm的微孔滤膜过滤，用水稀释一定量的倍数后，进行hplc 分析。2.2.2蒲公英根多糖的衍生准确称取蒲公英精制多糖5 m

11、g,加入2 mol/l的tfa溶液1 ml封管，110°c水解2 h,得 到多糖的水解样品溶液，取多糖水解液100卩1按照221项目“与1 ooplpmp/甲醇溶液(0.5 mol/l)混合”开始，进行衍生化处理。2.2.3色谱条件色谱柱：zorbax eclipse xdb-c18, 250 mmx4.6 mmi.d., 5 pm；流动相：0.1 mol/l 的磷酸盐缓冲液(ph=6.7)/乙月青(体积比为83:17)；流速：lml/min；紫外检测波长：245 nm；进 样量：20(11；柱温：室温。2.2蒲公英多糖结构初步分析2.3.1紫外光谱分析称取精制多糖样品适量，用蒸惚水

12、配制成一定浓度的溶液，以蒸憾水为空白，在200400nm范围内进行扫描。2.3.2红外光谱分析取精制多糖样品适量，用kbi压片，扫描范围为4000400cm"。3结果与讨论3.1多糖的组成分析结果3丄1色谱条件的优化为实现蒲公英多糖各组成单糖的高效分离，本实验对蒲公英多糖中可 能含有的glc、rha、gal、xyl、ara五种标准单糖pmp衍牛物的高效液相色谱分离条件进行 了优化，优化结果为磷酸盐缓冲液(na2hpcunah2po4)的ph为6.7时，采用等度洗脱的分 离模式能够使以上5种单糖衍生物得到较理想的分离见图la。312衍生方法的优化 用氨水进行衍牛，无需对反应后的溶液进行

13、中和，直接用氯仿萃取， 用水稀释后进行hplc分析。简化了实验步骤、缩短了样品的处理时间，避免了干燥后的衍 生物由于难溶而引起的误差，结果使定量更加准确。如图la和图lb,从图的纵坐标可看出 优化后峰高均增加近1倍多。多糖样品的色谱图见图2.图1单糖标准品pmp衍生物色谱图(a：有干燥过程；b无干燥过程)1、pmp； 2、rha； 3、glc； 4、gal； 5、xyl； 6、arafig 1 chromatogram of pmp derivatives ofmonosaccharides standard (a: with drying； b:without drying)图2蒲公英多糖h

14、plc图谱fig 2 ultrasonic synergistic enzymatic extraction of taraxacum polysaccharide hplc chromatogra3.1.3多糖的单糖组成 精制蒲公英多糖a、b、c、d中均含有d鼠李糖、葡萄糖、d半乳 糖、d木糖、d阿拉伯糖等5种单糖，除此之外，还含有其它多种单糖。测定结果为：a 的单糖的摩尔比为：rha：glc：gal：xyl：ara=0.098：2.88：0.125：0.017：0.33,b 的单糖的摩尔比为：rha：glc：gal：xyl：ara=0.113:0.68:0.13:0.011:0.19,c

15、的单糖的摩尔比为：rha:glc：gal:xyl：ara =0.139:2.46:0.36:0.13:0.086,d 的单糖的摩尔比为：rha：glc：gal：xyl:ara =0.028:0.36:0.031：0.012：0.94o3.1多糖紫外光谱测定结果分级后的蒲公英多糖在260nm和280nm处均没有吸收峰，说明蒲公英多糖不含有核酸和 蛋白质，在其他波长处无特征吸收峰，符合多糖类化合物的结构特点。3.2多糖红外光谱测定结果图4是用不同浓度nacl溶液洗脱获得蒲公英多糖红外光谱图。可以看出，糖类分子中含 有大量的oh, o-h伸缩振动多在32003600cm"之间出现强而宽的吸

16、收峰。蒲公英多糖在 3421 cm"1有强而宽的吸收峰，为oh的伸缩振动峰；2943cm"出现弱吸收，为ch伸缩振动 峰；在1700400cm"有明显的不同的吸收，说明四种多糖在结构上有明显的不同。rn2) aoueuesusl0 20mot/l n«cio15movlnaa4000350030002500200015001000500wavenumber （cm1）图4蒲公英多糖的红外光谱图o 1omovl m*ci参考文献1jtuo h s. immunity chinese pharmacy（免疫中药学）mj.beijing: peking uni

17、on medical college press, 1999: 188-191.2fu x p, yang x j.extraction and determination of the polysaccharides from dandelion（现代食品科技）j modern food science and technology（食品科学和）,2007, 23（6）: 3739.卩aimei lu piangui yu protective effects of lentinan on ho-induced oxidative damage in primary cultured rat

18、 cortical neurons（香菇多糖对 比。2（损伤神经细胞保护作用的研究）j.chinese journal of modem applied pharmacy（中国现代应用药学）j200&25（5）:393396.4 li g r. study on isolation of lycium barbaruni polysaccharide and its effects on anti-activc oxygen free radicals（枸杞多糖的提取及其对活性氧 自由基的清除作用）j chinese journal of modern applied pharmacy（中国现代应用药学）.2002,19（2）:9496.5 cheng je zhang y； he j r. efleet of astragalus polyaaccharidcs（aps）on the decrease of the leukcocytes and the marrow karyotes in chemotherapy mice（黄罠多糖对小鼠化疗中白细胞和肯册冇核细胞减少的影响）j chinese journal of modem applied pharma