霍乱弧菌分子生物学检测技术应用

1、霍乱弧菌分子生物学检测技术应用【摘要】现今，随着分子生物学的快速发展，许多 先进的分子生物学技术都被应用于对霍乱弧菌的研究，不仅 为霍乱弧菌的检测以及快速分型提供了十分重要的依据，还 从分子水平上阐明了霍乱疫情的形成，流行性质，菌株类型, 以及霍乱弧菌的变异和遗传情况。【关键词】分子生物学；相关检查技术；霍乱弧菌霍乱是由霍乱弧菌感染引发的一种流行广泛的甲类传 染病1。霍乱弧菌是肠道传染病霍乱的病原体2。人类是 霍乱弧菌的唯一易感者3。被感染者，往往表现为腹泻、 剧烈呕吐、脱水、甚至死亡。从1817年至今，人类累计经 历了 7次大规模流行的霍乱。霍乱，它具有起病急骤、传播 迅速、波及广泛、病死率

2、高等特点，霍乱弧菌广泛的分布自 然界中，可以通过污染水源及食物而引发疾病。对于霍乱的 预防及治疗的关键在于，及时监测疫区外环境标本。对霍乱 弧菌做出迅速、准确的检测是霍乱防治的重要方法。传统的 分离培养方法费时费力，不能适应疾病的快速发展，将分子 生物学的相关检测技术应用于对霍乱弧菌的检测，可精准、 快速的进行检测，为疫情的处理，临床诊断提供了及时可靠 的依据，同时也可有效追踪传染源，确定霍乱菌株类型，预 测霍乱的流行趋势。本文将对几种用于霍乱弧菌分子生物学 检测技术，作简单的介绍。1 pcrpcr技术主要包括：普通pcr、荧光pcr、套式pcr、多 重pcr等。1. 1普通pcr普通pcr是

3、通过检测出霍乱弧菌0139和 01菌群的ctxa、ctxb基因，继而检测属于霍乱弧菌并检测 出其毒力基因的常规方法。shirai4依据lt和ct的高度 同源性，建立了基于ctx基因的特异的pcr检测方法，它检 测细菌染色体的灵敏度很高，能检出仅含三个活菌的样本。1.2荧光pcr荧光定量pcr,它是通过荧光或者荧光燃 料标记的特异探针，对pcr的产物进行跟踪标记。它具有无 需电泳、快速定量、无交叉污染等诸多优点，被广泛的应用 于临床。应用荧光pcr可快速有效的检测出霍乱弧菌0139 群、01群、非0139群、非01群毒素的相关基因。1.3套式pcr套式pcr,也可称为巢式pcr,即使用两 对pr

4、c引物来扩增完整的片段。套式pcr中，第一对引物扩 增片段的方式与普通pcr极为相似，第二对引物也叫做巢式 引物，他们往往结合在第一次pcr产物的内部，这就导致第 二次pcr扩增的片段会短于第一次。巢式pcr,它具有非常 高的特异性。susanna等依据0139群0抗原合成相关基因片 段建立的套式pcr可用于0139群霍乱弧菌的特异检测5 o1.4多重pcr多重pcr,也可称为复合pcr或者多重引物pcr,它是在同一个pcr反应体系中加入两对及以上的引 物，在同一时段，扩增出许多的核酸片段，它具有高效性、 系统性、经济便捷性等诸多优点。2 aflpaflp （扩增片段长度多态性）是一项新型的分

5、子标记技 术，是由荷兰的pieter vos等在1993年发展起来的一种多 态性dna检测新方法，它具分析需要dna含量少，可重复性 好，多态性强，分辨率高，无放射线损害，适用性广，稳定 性好等诸多优点。aflp技术的原理：对基因组酶切后的片段, 进行选择性扩增，已获取的扩增片段经电泳检测，继而检测 出获得的不同长度的扩增片段。jiang6采用aflp技术分 析不同环境，不同地点的临床分离的霍乱弧菌多态性，结果 显示分离的临床0139菌株及01菌株在遗传学关系上要比环境中的0139菌株及01菌株更为紧密。aflp分析与pfge、rflp、rapd、rep-pcr 等适应范相似，并兼备以上各种方

6、法的优点，且分辨率极髙，稳定性强，可为临床工作提供丰 富信息3 pfgepfge （脉冲场凝胶电泳）是一种常用的分离大分子核酸 的方法。用脉冲场凝胶电泳对霍乱弧菌进行分型，其分辨力 更高，可为霍乱弧菌分离株间进行同源性分析、遗传相关性 分析、追踪传染源、预测疫情变化、防治措施的制定提供可靠依据。脉冲场凝胶电泳分辨力髙，重复性好，即使在不同 实验室，所得结果仍具可比性。4 mlst 和 mleemlee （多位点酶电泳法），它以一个基因一种酶学说为依据,通过监测酶电荷及分子量的变化情况,来推算对应位点的多态性，然后进行综合分析，从而获悉细菌的具体分型 及遗传学特点。但是，不同实验室间结果不可进行

7、比较。mlst （多位点序列分析），是一种新型的细菌分型技术, 它由mlee改良而来，它比pfge的分辨力更高。5 mlvamlva （多位点可变数目串联重复序列），是在pcr基础 上发展起来的新型技术，具有高度多态性的特点。对dna的 纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结果, 可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。6讨论pcr技术具有特异性强、灵敏度高、检测快速、成本低廉等诸多优点，但是，在菌株遗传关系分析及菌株分型方面 不如其他的分子生物学检测手段，所以，pcr技术在临床主 要被应用于早期对菌株的筛查。aflp技术是以pcr技术为基 础的新型技术，它继承了 pcr

8、的优势，但更加的可靠，与pcr相比，它可同时检测出大量不同的核酸片段，一次扩增就能 分析比较几十个甚至百个基因位点，且不需制备探针，不需预知基因的序列特点。但，aflp技术价格昂贵，对dna纯度, 内切酶质量有很高的要求，模板反应往往迟钝，还可能发生 缺失或错配的现象。与aflp技术相比pfge是一种操作简便、 稳定性好、分辨力高的方法。pfge已经被公认为多种细菌基 因分型的标准，是目前较为成熟的基因分型方法。但，pfge技术也具有一定的局限性，如耗时久，未形成国际同一标准, 不利于实验室间比较等。pfge技术与mlst相比，mlst建立 有大型的国际化数据库，可以进行实验室间的比对，也可作

9、 为国际流行病研究的依据。但mlst技术费用高，工作量大,技术要求极为严格，设备昂贵,所以并不适用于暴发流行的常规检测。mlva是以pcr为基础的新型分型方法，它对dna 的纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结 果，可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。综上所述，各种分子生物学检测手法各有千秋，可以互 相取长补短，我们可以根据检测的目的以及实验室的现有设 备选取合适的方法，用于临床诊断及研究。参考文献1 巩西玲.两种霍乱弧菌检测技术的应用研究j适宜技能，2013, 21 (12)： 134-134.2 吴以华，徐景野，李岳良，等微量培养板不同保存时间对霍乱弧菌培养效果

10、的观察j中国卫生检验杂志,2007, 27 (4)： 629-630.3 熊长辉霍乱弧菌分子生物学检测技术介绍j现 代预防医学，2012, 39 (17)： 4536-4537.4 shirai h, nishibuchim , ramamurthy t , et al. polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of vibraculariaj.j clin micro bio, 1991, (29)： 2517.5 dugo m, breggion g, susanna f, etal.acute renal failure in a patient with bilateral aneurysms of iliac common arteriesj. ren fail, 1996, 18 (4)： 689-6901.6 jiang s c, matte m, mat te g, et al. gene tic diversity of clini