细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

1、细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)一、消化与吹打版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能

2、把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论：1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打

3、成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是

4、一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者象有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现。3，另一个帖子里提到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是第一次听说，应该是网友自己发展出来的方法，很有参考价值。但我估计这个方法可能对付少数非常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我目前养过的近300株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Caco2其实是很好消化的细胞，不需要胰酶孵育即可，只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定

5、。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。4，比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT15, LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足够了，一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化

6、的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。5，常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态要求极高。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。6，EDTA的作用。许多人不用胰酶，只用EDT

7、A，或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。7，PBS洗涤。消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲，对于一些难消化细胞，那么可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对

8、于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞，不需要配制如此溶液。总结下来，虽然这个帖子是关于消化的，但其实消化并不是细胞培养的关键所在（虽然很重要），关键所在是细胞来源，血清质量和水源（自己配制溶液的话）。我看到版上许多人养细胞遇到各种各样的问题，很多时候bottleneck没有找到，虽然通过其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因为人们往往注意自己的操作，总觉得自己没有经验，而忽视试剂，溶液尤其是细胞的质量，后者其实才是许多细胞培养实验室常见的问题。 从最基础的地方教起，一步一步详细介绍细胞培养技术，非常好的开门教程常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅

9、、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4冰箱（放置serum和培养用液）。无菌操作无菌室的灭菌：定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔灭或者0.5过氧乙酸擦拭

10、。CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：肥皂洗手。穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋用75酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精灯火焰操作。器皿使用前必须过火灭菌继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废

11、液缸。吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：自来水刷洗，除去灰尘。烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升

12、时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数

13、随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好

14、滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。胶塞烘干后用2氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。胶帽，离心管帽烘干后只能在2氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。胶头可用75酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即

15、可。塑料培养瓶，培养板，冻存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时_这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC126H2O)2g，30盐酸10m1，蒸馏水88m1。注意事项：严格执

16、行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤：一. 水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，

17、不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：1.溶解定容：将药品（NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4H2O：1.56g，KH2PO4：0. 2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋

18、白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于

19、4内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20保存以备使用。四.青、链霉素溶液的配制于消毒1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位1微克？五.RPMI1640的制备与消毒：1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并

20、加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4冰箱内待用。5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4时两周有效）。六血清的灭火：细胞培养常

21、用的是小牛血清，新买来的血清要在56水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。七.HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4保存。注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可

22、根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。八.谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4下放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中

23、谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九.肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。十. 型胶原

24、酶：0.1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20保存。十一.明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4保存。其他培养用液的配制：20ug/ml内皮生长因子，注意事项：1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和

25、0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。细胞传代培养（消化法）具体操作：一. 传代前准备：1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。2.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消

26、毒。6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37。2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。三、吹打分散细胞：1

27、.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。四.分装稀释细胞：1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。五.继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养

28、。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个，占50为，占75时为。传代细胞培养注意事项：1.严格的无菌操作2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意

29、EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。细胞的复苏细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作一. 实验前准备：1.将水浴锅预热至372.用75酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二取出冻存管：1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。三迅速解冻：1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断

30、的摇动，使管中的液体迅速融化。2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min五.制备细胞悬液：1.吸弃上清液。2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。六.细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。七.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37和5CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1水浴锅未预热或者未预热到37。2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化

31、时间延长。3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照传代细胞培养（消化法）中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。二.细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。三.细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。2.制备计

32、数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml （ 四个大格子细胞数/4) 

33、15;2×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3四.细胞计数要点：1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团

34、时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。五.初学者易犯的错误：1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。六.本实验特殊试剂的配制：4台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4即可。细胞的冻存1.先将冻存管放入4冰箱，约40min。2.接着置于-20冰箱，约30-60min。3.置于-80超低温冰箱中放

35、置过夜。4.置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。注意事项：1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。2.不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。细胞培养三不要养细胞是医学研究生的基本功。我养过骨髓MSC、心肌细胞、心肌成纤维细胞、AD293腺病毒包装细胞、PA317逆转录病毒包装细胞。养得最多的是MSC。有三个小经验和大家

36、分享一下：1. 不要烧瓶口。大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸/碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）其实烧瓶口防止污染纯粹是心理安慰。不妨试一下把手指在火上晃几下，你会发现根本就不会烧疼。如果有细菌的话，这么晃两下也烧不死

37、多少。要想烧死全部细菌，除非把瓶口和塞子烧红。我在国内从来就不烧瓶口。来美国以后发现这里更彻底，超净台内根本就不点酒精灯。2. 不要频繁看细胞。对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。经常可以看到新手一天到晚都在看细胞，细胞老是长不好。老手细胞一扔好几天不管，细胞疯长。3. 不要怕消化。在传代的时候，初学者往

38、往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，37度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞完全变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。 原代培养技术一、组织块直接培养法1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内

39、注入适量的培养液，将培养瓶放置在37恒温箱内培养。5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37继续培养。二、消化培养法1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。3、视组织块量加入酶液，37中消化2040分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。4、加入35ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。5、静置510分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。7、加入Ha

40、nk's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。8、加入培养液12ml（视细胞量），血球计数板计数。9、将细胞转移到培养瓶中，37下培养。三、 器官培养1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5m孔径滤膜。2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200m，水平面积不超过10mm2 。4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一

41、次，并根据情况做进一步实验和检测。胚胎干细胞培养：从技巧走向科技实验室培养人类胚胎干细胞是个不小的壮举，培养的讲究，易溶细胞劳动密集型，在一定程度上与其说是精密科学不如说是技巧。然而，现在，威斯康星大学麦迪逊分校（the University of Wisconsin-Madison）一研究小组报告，研制了一个完全确定的培养体系，为细胞治疗提供更均一更安全产品The journal Nature Methods Nov.14上报道，该小组由Laura Kiessling领导，一位威斯康星大学麦迪逊分校化学教授，介绍了一种廉价的、能（适应）所有细胞的（培养）系统，从而免受培养（操作过程中）的不确

42、定性工作（或因素的影响）。“这是一项很简单的技术，任何人都能使用” Kiessling说。目前，人类胚胎干细胞培养的大多是用于研究，然而，随着时间推移培养系统会改进，科学家们仍用鼠源细胞及蛋白的支持干细胞生长的“表面”培养人类细胞，诱导胚胎干细胞。如此会增加病原体，如病毒，如果培养的干细胞用于人体治疗，这是一个严肃的问题（涉及生物安全）。新的培养系统利用一种人工合成的化学方法制成蛋白片段及多肽基质，对干细胞有亲和作用。结合界定的培养基，由威斯康星团队设计的培养系统可以让细胞处在未分化状态保持3个月或更长。根据新的报告，该系统也适用于诱导多能干细胞，成人细胞经过遗传学重编类似于胚胎干细胞。Kie

43、ssling表示，在该系统，细胞经常被检测是否分化为所需的细胞类型，在一定时间内与市售有效的细胞培养系统对比看是否达到一致。Kiessling表示，首个人类胚胎干细胞临床试验在进行中，正在启动人类患者更多试验，相信在安全性问题上是至高至上的。Kiessling解释，目前通常使用的培养系统是不确定性，并没有真正知道细胞是否接触，且无均一性，代与代之间是否存在变异。而我们研发的系统是确定的并且是廉价的。Kiessling的研究小组的工作得到了美国国立卫生研究院和威斯康星材料科学与工程研究中心大学的支持。细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。化学污染化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺

44、激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。生物污染生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在

45、合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。1956 年 Robinson 及其同事首次发现细胞培养中的支原体污染。90年代初美国的一个调查发现，在该国的细胞培养中，至少有15%被支原体污染。由于支原体没有细胞壁，在细胞培养液中几乎是透明的，同时对常用于细胞培养中的抗生素

46、不敏感，不引起 pH 变化，不使培养液浑浊，所以支原体污染不容易被发现，但是其存在会影响实验的结果。细胞的交叉污染在细胞培养中发生的严重程度大大超过人们的想象：1981 年对ATCC细胞株的调查显示：超过 60 标记为其他细胞株的细胞居然是 HeLa 细胞。细胞培养细节问题1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70

47、% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4. 工作人员应注意自身之

48、安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750

49、)，定期更换水槽的水。基础篇-实验用品1. 种类 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透明材质，polystyren

50、e (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml2. 清洗 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3. 灭菌 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121, 15 lb, 20 分钟，置于oven

51、 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 , 15 lb, 20 分钟处理。基础篇-培养基1. 液体培养基贮存于4 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 水槽中温热。2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3. 粉末培养基配制(以1 升为例)： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.

52、2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。3.2. 材料： 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) ，粉末培养基 ，NaHCO3  ，电磁搅拌器 无菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 ，pH 计，真空泵，CO2 气体3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml mill

53、i-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。(血清亦可加入培养基中一起过滤) 3.3.

54、5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。附-配制培养基之生长测试材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)步骤： 1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 × 102 活细胞，同时作对照组实验。 2. 接种57 天后，在100 倍

55、倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。 3. 去除培养基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室温下静置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室温下静置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。基础篇-抗生素1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。 1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token f

56、reeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制mycoplasma 生长。4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitraci

57、n 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。5. 抗生素使用种类与浓度：抗生素工作浓度储存温度杀灭细菌penicillin(青霉素)100 units/ml-20G(+) bacteriastreptomycin(链霉素)100 ug/ml-20 G(+) and G(-) bacteriaamphotericin B(潮霉素B)2.5 ug/ml-20yeast and moldsfungizone2.5ug/ml-20yeast and moldsChlotetracycline(金霉素)50 ug/ml-20G(+) and G(-) bacteriagentamicin(庆大霉素)50 ug/ml-20G(+) and G(-) bacterianystatin(制霉菌素)50 ug/ml-20yeast and moldsamphotericin B(潮霉素B)2.5 ug/ml-20yeast and molds基础篇-血清1. 血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将404