血红蛋白的分离纯化与理化性质研究

1、生物科学大实验 华中科技大学生命科学与技术学院 生科大实验报告题目：血红蛋白的分离纯化与理化性质研究专业班级：某某班姓名：某某某 指导教师：某某某实验时间：2015年9月28日至 2015年10月20 日提交报告时间： 2015年11月22日摘要血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb

2、)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。Abstract Hemoglobin（Hb）is one of poly-subunit proteins composed of four units in the animal blood. It has the important p

3、hysiological function that is the oxygen transport carrier.  In the process of Hb combining with oxygen and releasing, it embodies positive cooperative effect of the interactions between the various subunits in the allosteric protein. It has a strong representative and is a good material for st

4、udying the characteristics of allosteric proteins. Besides,its monomers structure is similar to a major meat chromoproteinMyoglobin(Mb).They are all heme protein that have a heme active center. Mb has only one subunit, but Hb has four subunits. Hb is about four times that of Mb. Hb and Mb have three

5、 kinds of natural induced body configuration, type the oxygenation (foxy - Hb; foxy - Mb), reduced (Red - Hb; Red - Mb) and oxidation type (Met - Hb; Met - Mb). The same configuration of two proteins has the same color and similar spectroscopy characteristics.目录摘要-2目录-3一、 选题背景1.1血红蛋白简介-51.2血红蛋白

6、的生理意义及分离提纯的作用-52、 方案论证 2.1实验材料及试剂-6 2.2分析方法-6  2.2.1蛋白质浓度的测定-6  2.2.2血红蛋白的测定-7  2.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳-8 2.3血红蛋白的提取分离-9  2.3.1动物血液的收集与处理-9  2.3.2红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备-9  2.3.3盐析沉淀-9  2.3.4Sephadex G-75色谱纯化-10 2.4血红蛋白的纯度鉴定-10  2.4.1制胶-10  2.4.2架好胶板，检漏-11  2.4.3灌胶并

7、水封-11  2.4.4制孔-11 2.4.5加样-11  2.4.6电泳-11  2.5.7染色-11  2.5.8脱色-113、 结果与讨论 3.1 蛋白质标准曲线-12 3.1.1酚试剂甲液的准备-12 3.1.2酚试剂乙液的准备-12 3.1.3蛋白质标准溶液的准备-12 3.1.4操作过程-12 3.2 血红蛋白盐析曲线-13 3.3 Sephadex G-75 柱层析图谱-14 3.4 各步提纯结果-15 3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱-15四、实验总结与分析-165、 实

8、验体会与心得-166、 参考文献-17一、选题背景1.1血红蛋白简介血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型

9、 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能

10、特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。 1.2血红蛋白的生理意义及分离提纯的作用血红蛋白的四级结构对其运氧功能有重要意义。它能从肺携带氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。现知它的这种功能与其亚基结构的两种状态有关，在缺氧的地方（如静脉血中）亚基处于钳制状态，使氧不能与血红素结合，所以在需氧组织里可以快速地脱下氧；在含氧丰富的肺里，亚基结构呈松弛状态，使氧极易与血红素结合，从而迅速地将

11、氧运载走。亚基结构的转换使呼吸功能高效进行。血红蛋白分离提纯后可用于生化研究，培养流行性感冒病毒、淋球菌、兔热病杆菌、链球菌、肺炎球菌等，色素。二、方案论证2.1实验材料及试剂实验材料：猪抗凝血液实验试剂：抗凝剂肝素（1250U/mL）、生理盐水、饱和硫酸铵溶液、Folin-酚试剂、文齐氏液、0.1 mol/L磷酸缓冲溶液（PH=7），其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。2.2 分析方法2.2.1蛋白质浓度的测定： 采用Folin法测定各管中蛋白质的总浓度：蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色

12、法测定蛋白质浓度。2.2.2 血红蛋白的测定： 采用文齐氏液测定血红蛋白的浓度：检测原理：文齐氏液是氰化法（HiCL法）的稀释剂，当血液加入文齐氏液内，将血红蛋白两价铁氧化为三价铁，它再与氰化物结合形成稳定棕红色的氰化高铁血红蛋白，这种溶液在540nm波长的血红蛋白计或绿色滤光片的光电比色计上测定人血液中的血红蛋白浓度。稀释液质控：本品为浓缩试剂，使用时吸10ml浓缩型试剂加蒸馏水至500ml，并装于棕色瓶内。若当天使用后仍有剩余试剂，则应放在48冰箱内保存。如果溶液发生混浊或在750nm波长处比色（蒸馏水做空白管），其吸光度（A值）大于0.003时，则不可继续使用。产品组成和性能：本品由有机

13、表面活性剂、磷酸盐和氰化物组成，溶液呈淡黄色清亮透明，五沉淀物和絮状物。适用范围：该产品适用于氰化法测定人体血液血红蛋白含量时稀释血液用。操作步骤：标定过的吸管准确吸取20微升血液，放入盛有已50倍稀释后的5ml文齐氏液的试管内，吸吸管内至无色，然后摇匀并放置5min，在校正过的血红蛋白计或光电比色计上测定血红蛋白浓度。2.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理： 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳

14、可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是分子量的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDSPAGE)。由于SDS PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度

15、，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDSPAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDSPAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成。步骤：1样品的浓缩效应以往不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(TrisGly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri sHCl， pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的

16、HCl几乎全部解离成Cl一，两槽中的Gly(pI一6.0，pK a=9.7) 只有很少部分解离成Gly的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子存电泳时都向正极移动。Cl一速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly负离子最慢(尾随离子)。离子Cl一很快超过蛋白离子，因此存其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电化梯度最高，这是在电泳过程中形成的电化梯度的不连续性，导致蛋白质和G1y离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。2分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过90)，使Gly解离

17、成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相百分开。 2.3 血红蛋白的提取分离提取分离实验流程：2.3.1动物血液的收集与处理取动物血液80-100ml，按 1：1 加入抗凝剂肝素（1250U/mL）混匀备用。将抗凝血液分装在4支50ml离心管中，3000 r/min ，4，离心1

18、0 min，弃去上清 ,收集红血球。向压积红细胞中加3-5倍量预冷的生理盐水，轻轻搅匀洗涤，3000 r/min ，4，离心10 min，吸出上清液弃去。再用生理盐水如上洗涤3次、最后吸出上清液弃去，收集红血球。2.3.2红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备方法一：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置4冰箱中过夜 ,使其自然溶胀破碎，10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。方法二：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置-20冰箱中冰冻过夜 , 次日将冰冻红细胞放置室温或37水浴使之融化，摇匀，10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白

19、溶液（血红蛋白粗提液）。方法三：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间30秒X秒（180秒）。10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】2.3.3盐析沉淀取50ml血红蛋白粗提液制作盐析曲线，剩余部分（准确量体积）用于血红蛋白的盐析制备。（1）血红蛋白盐析曲线的制作（需要粗酶液4050 ml）a.取7支干净试管编号17，分别加入粗酶液5 ml； b.分别向15号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5

20、ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml×2混匀的溶液装入7ml×2离心管中，对应编号1、1/7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用文齐氏液测定血红蛋白。e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和血红蛋白的含量为纵坐标作

21、图，得到蛋白质盐析曲线和血红蛋白盐析曲线。（2）盐析制备血红蛋白根据血红蛋白盐析曲线选择硫酸铵饱和度(40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(60%饱和度)沉淀血红蛋白。并计算每升溶液达到40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据血红蛋白粗提液的体积计算40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。在血红蛋白粗提液中加入经研细的(NH4)2SO4粉末 ,使其达到40%饱和度,充分溶解后,4，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。收集上清夜。继续向上清液中加入(NH4)2SO4粉末，使其达到 60 %饱和度 ,充分溶解后，4，10000 r/m

22、in ,离心 20 min ,弃去上清液，收集沉淀。-I将沉淀溶于少量蒸馏水中 ,加磷酸盐(K2HPO4 NaH2PO4 =1 1 ,1mol/1mol)达到 1 mol/L ,充分混均 ,4 放置约48 h后（可见血红蛋白粗结晶生成），4，10000 r/min，离心20 min ,将浮在上面的结晶收集 ,4 保存。-II将沉淀溶于少量0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液中,进一步纯化。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】2.3.4 Sephadex G-75色谱纯化 选用15×600800mm Sephadex G-75或Sephadex G-100

23、色谱柱，加样量为 35mL （约含蛋白60100mg）用 20mmol/L （pH为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用 A280 的紫外线进行检测。如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取 0.5mL 稀释 10 倍后用紫外线测量的结果。 以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集血红蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进行蛋白质纯度的鉴定。剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品血红蛋白）。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】2.4血红蛋白的纯度鉴定 采用聚丙烯酰胺凝胶

24、电泳。2.4.1制胶 按上图所示配制各溶液，分离胶，浓缩胶。2.4.2架好胶板，检漏 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线方式旋紧螺丝帽。 竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅模框交界的缝隙内加入已融化的1琼脂，其目的是封住空隙，凝固后的琼脂应避免里面有气泡。待完全凝固后可先用蒸馏水进行检漏。2.4.3灌胶并水封 将制好的分离胶用胶头滴管缓慢均匀地灌进胶板中间，加至距离样品模板齿梳下端约45mm处即可，剩下的部分加满蒸馏水。2.4.4制孔 待分离胶凝结后，将水倒出，用滤纸吸干水分，将浓缩胶加入胶板中并插梳子，待浓缩胶完全凝结后加入电工缓冲液，拔出梳子。2.4.5加样冷冻干燥的样品溶

25、于200 µl的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中，并与40%蔗糖按1:1混合，另加入少许0.1%溴酚蓝指示剂，向每个凝胶凹形样品槽内加入20 µl样品。2.4.6电泳 连好线，打开电泳仪开关，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离胶时， 将电流调至20-30mA，当蓝色染料迁移至距离橡胶框下端1cm时，电泳完成。2.4.7染色 用0.05%考马斯亮蓝R250染色液，染色30min左右。2.4.8脱色 用脱色液脱色，直至胶背景的蓝色完全褪去，可以看清楚蓝色的条带。三、结果与讨论3.1、蛋白质标准曲线本实验过程中采用Folin酚法测蛋白质浓度： 3.1.1酚试剂甲液的准备(1

26、) 取 10g碳酸钠、2g氢氧化钠和 0. 25g酒石酸钾钠 (或其钾盐或其钠盐 )溶解于500mL蒸馏水中。(2) 取 0. 5g硫酸铜 (CuSO4 ·5H2O)溶解于 100m l蒸馏水中。(3)每次使用前将 (1)中的 50m l溶液和 (2)中的 1m l溶液混和 ,即为酚试剂甲液 ,当天使用。3.1.2酚试剂乙液的准备 实验室已有。3.1.3蛋白质标准溶液的准备配制250g/mL的标准蛋白溶液。3.1.4操作过程1234567标准蛋白溶液/mL00.10.20.40.60.81.0H2O/mL1.00.90.80.60.40.20甲液/mL5.0混匀，于20-25放置10

27、min。乙液/mL0.5迅速混匀，于30水浴30min，H2O为空白对照，640nm比色数据记录：作标准曲线：结果分析： 此实验过程中采用的标准蛋白浓度是250g/mL，用分光光度计测吸光度时用波长为640nm的可见光，结果表明：在一定范围内，蛋白质溶液在640nm处的吸光度与浓度存在着线性关系，线性关系可用图中的回归方程表示。该曲线是蛋白质浓度标准曲线，对于未知浓度的蛋白质溶液，可测定其在640nm处的吸光度，根据线性回归方程可以估算出其浓度。3.2、血红蛋白盐析曲线数据记录：蛋白质溶液浓度单位转换为mg/mL,得：制作曲线：结果分析：从上图中可以看出，溶液中硫酸铵饱和度越高，析出的蛋白质沉淀越多，呈正相关。开始时，硫酸铵饱和度较小，析出沉淀很少；硫酸铵饱和度达到40%左右时，开始有明显沉淀；硫酸铵饱和度达到60%左右时，蛋白质沉淀陡增。硫酸铵饱和度继续增加时，蛋白质析出的量将趋去平缓。整个曲线呈S型。所以实验设计时，选择饱和度为40%的硫酸铵来沉淀杂质蛋白，饱和度为60%的硫酸铵来沉淀血红蛋白。 3.3、Sephadex G-75柱层析图谱数据记录：作血红蛋白柱层析图谱： 结果分析： 蛋白质盐析后，对蛋白样进行柱层析，以A280测量值为纵坐标，试管编号为横坐标绘制柱层析图谱，收集血红蛋白洗脱峰。本次实验共收集30管蛋白样，每管4mL,对应的吸光度如上图所示