(完整word版)GST_pull_down试验方法(自己总结)(2),推荐文档

1、12. GST 蛋白的表达和纯化 12.1 GST 蛋白的表达 (1) 将表达 GST 融合蛋白的质粒转入 BL21 大肠杆菌菌株中。 (2) 挑单克隆于 3ml LA(LB+Amp)培养基中，37C摇菌过夜，获得种子液。 (3) 将种子液稀释于 50ml2XYTA(YTG+Am 培养基中，使起始 OD60Q 为 0.1。 (4) 28C,220rpm 摇菌培养 2 小时。 (5) 加入 50 pl 100mM IPTG,1627C摇菌培养 18 小时。 (6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2 管/50ml 菌液，4C 5krpmx5min 离心，弃 上清。 (7) 加入 10ml PBS/管，

2、重悬细胞,5krpm 离心 5min,弃上清。 (8) 加入 2ml PBS/管，重悬细胞。转移至 5ml 离心管。 ( 9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加 20pl 10mg/ml PMSF,80 pl 蛋白酶抑制剂 (100 x) 。 破壁参数： Frequency:100 200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles 破至菌 体由浑浊变为澄清。 加 100pl 20% TritonX 100，冰上放置 30min。 (10) 将裂解液分入 1.5ml 离心管中，4C离心 12krpmx 10min，取上清。 (11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在

3、沸水中煮 3min。离心 (12krpm,1min)，取上清作 SDS-PAG 电泳，检测表达情况。 12.2 准备 50%GST Sepharose 4Bslurry ( 1) 将原 75%Glutathione Sepharose 4B 的 slurry 弹至混匀。 (2) 取 677 p原液/管，3krpm 离心 5min,弃上清。 (3) 加 500 p PBS 颠倒混匀，3krpm 离心 5min,弃上清。反复 5 次。 (4) 力卩 500 p PBS 颠倒混匀，配成 50%Glutathione Sepharose 4B 备用。 12.3 GST 融合蛋白的纯化 ( 1) 在新鲜

4、制备的细胞裂解液上清中加入 20pl 50%Glutathione Sepharose 4B， 4 C，摇床上摇，反应 30min60min。 (2) 3krpm 离心 5min，弃上清。该 Sepahrose 上即结合了 GST 融合蛋白，(如果 仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高， 可以只接合一次， 如果要结合更多 则接着往下做) (3) 在管中加入离心后的 1.5ml 新鲜制备的细胞裂解液的上清，4C,反应 30min60min。3krpm 离心 5min,弃上清。重复该步骤多次，就可以使Sepahrose 上结合 610ml 裂解液中的 GST 融合蛋白。 (4) 在管中加入预冷的

5、 200pl PBS(沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与 蛋白的联接),轻晃悬浮珠子，将 Sepharose 洗涤一次，3krpm 离心 3min,弃上 清。 (5) 反复三次(最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽 量吸净但不吸走珠子)，即获得结合有 GST 融合蛋白的 Sepharoseo (6) 如果用于检测，在 Sepharose 加入 1520 pl 1X蛋白电泳上样缓冲液，在 沸水浴中煮 3min。12krpm 离心 1min，取上清作 SDS-PAG 电泳。 (7) 如果用于 pull down 测试，参见 pull down 步骤。 14. 体外蛋白质结合分析

6、( GST-pull down ) (1) 将结合有 GST 融合蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 悬浮在 500JNETN 缓冲液中加入 2030 p含有其他蛋白的溶液， 例如 pET 发酵的产物,细胞表达的 产物等，同时采用结合有 GST 空蛋白的 Glutathione Sepharose 4B 平行操作作 为对照。 (2) 在水平摇床上， 4 晃动 48 小时。 (3) 离心( 3.6krpm,2min )。吸去上清，注意不要扰动底层的 Sepharose. (4) 加入 200 p缓冲液 H 对 Sepharose 进行洗涤。注意加入缓冲液 H 时要贴壁 加，

7、不要直接冲击 Sepharose，随后轻柔晃动，使 Sepharose 重悬即可。 (5) 低速离心(3krpm, 2min)吸去上清，注意不要扰动底层的 Sepharose。 (6) 重复步骤的洗涤 23 次。 (7) 吸干 Sepharose 上方的水层后，加入 2030 p 1X蛋白电泳上样缓冲液， 沸水浴 4min，冻存于20C。 (8) 做 SDS-PAGE 口 Western 检测另一个蛋白。 GST 试验流程(梗概) ： ( 1) Glutathione 琼脂糖珠预处理。 (2) GST融合蛋白挂柱： 取适量 GST融合蛋白与10pl已经处理过的beads 置于 1.5ml 离心

8、管中， 4C , 摇床孵育过夜。 (3) 孵育过夜的蛋白质与 beads 的混合液于 4C,500g 离心 5min,上清收集， 观察融合蛋白是否饱和地挂在 beads 上，用 1ml 冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次 beads。 (4) 把转染目的基因的细胞(5X106)裂解在 0.5ml细胞裂解液里(含蛋白酶 抑制剂)，最大转速 4C离心 20min,收集上清液。 (5) 将细胞裂解液上清加入 beads 中，混匀，4C,摇床 3h 6) 3h 后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。 (7)力卩 15 卩 l 2 x SDS 上样缓冲液，煮沸 5min. 8) SDS-PAGE,Western B

9、lot 或质谱仪分析。 (9) 对照(GST 同样处理。 13. pET 融合蛋白的表达与纯化 13.1 pET32a 融合蛋白的表达 (I) 将表达融合蛋白的质粒转入 BL21DE3 中。 ( 2) 挑单克隆于 3ml LA 培 养基 中，37r摇菌过夜，获得种子液。 (3)将种子液稀释于 50ml 2XYTG 中，使起始 OD600 为 0.1。 ( 4) 28r ,220rpm 摇菌培养 2 小时。 (5) 加入 50 pl 100mM 的 IPTG,22C 摇菌培养 6 小时。 (6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2 管/50ml 菌液，4C 5krpm 离心 5min,弃 上清。 (7

10、) 加入 10ml Ni-lysis buffer/ 管，重悬菌体。5krpm 离心 5min，弃上清。 ( 8) 加入 2ml Nilysis buffer/50ml 菌液， vortex 重悬菌体。转移至 5ml 离 心管。 ( 9) 超声破壁 破壁前，在细胞悬液中加 20pl 10mg/ml PMSF,80ul 蛋白酶抑制剂。 破壁参数：Frequency:100 200w,60s pause20s run 40s,5cycles 破至菌体由 浑浊变为澄清。 加 100pl 20%TritonX100 ，冰上放置 30min。 (10) 将裂解液分入 1.5ml 离心管中，4C 离心 1

11、2krpmx 10min，取上清。 (II) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮 3min。离心 (12krpm,1min)，取上清作 SDS- PAGE 电泳，检测表达情况。 13.2 pET32a 融合蛋白的纯化 (1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入 20 p Ni-NTA 珠子，4C，摇床上摇 反应 30min 60min。 (2) 离心 3krpmx 5min,弃上清。该珠子上即结合了 pET32a 融合蛋白，(如果 仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高， 可以只接合一次， 如果要结合更多 则接着往下做) (3) 在管中加入离心后的 1.5ml 新鲜制备的细胞裂解液

12、的上清，4C,反应 30min60min。离心 3krpmX 5min,弃上清。重复该步骤多次，就可以使珠子上 结合610ml 裂解液中的 pET 融合蛋白。 (4) 在管中加入预冷的 200 pl Washbuffer (沿壁加入，小心勿剧烈，以免打 断珠子与蛋白的联接)，轻晃悬浮珠子，洗涤一次，离心 3krpmx3min,弃上清。 (5) 反复三次(最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余次可以中枪吸，尽量 吸净但不吸走珠子)，即获得结合有 pET 融合蛋白的 Ni-NTA。 ( 6) 加入 60pl Elution buffer ，不必吹打， 晃动洗脱蛋白。 离心 3krpmx5min， 吸

13、净上清，pET 融合蛋即在上清中。 (7)如果用于检测，取 12 pl 样品，配成 1520 p 1X蛋白电泳上样缓冲液， 在沸水浴中煮 3min。离心 12krpmX 1min，取上清作 SDS-PAG 电泳。 ( 8) 如果用于 pull down 测试，参见 pull down 步骤。 GST pull down 与 IP 之间区别： Co-IP 一般来说是证明两个蛋白的相互作用，但不排除通过第三个蛋白介导的间接相互作 用。 GST pull down 一般可用来证明直接的相互作用。 GST pull down 也并非都是原核表达来源，真核也可以表达作为饵蛋白 GST pull-down 实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术 ,近年来越来越 受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白 -GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂 上 ,作为与目的蛋白亲和的支撑物 ,充当一种 “诱饵蛋白 ”目,的蛋白溶液过柱 ,可从中捕获与之 相互作用的 “捕获蛋白 ”目(的蛋白 ),洗脱结合物后通过 SDS-PAGE 电泳分析 ,从而证实两种蛋 白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白 , “诱饵蛋白 ”和“捕获蛋白 ”均可通