平板划线法分离菌种

1、实验六 平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法 是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。 一般是将混 杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞， 通过在分区的平板表面上作多次 划线稀释， 形成较多的独立分布的单个细胞， 经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。 通常 认为这种单菌落就是某微生物的“纯种” 。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可 形成一个单菌落， 故在科学研究中， 特别是在菌种鉴定等工作中， 必须对实验菌种的单菌落 进行多次划线分离，才可获得可靠的纯

2、种。平板划线分离对细菌、 酵母菌较为适宜， 而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行 菌种的分离纯化。具体的划线形式有多种， 这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方 法：将一个平板分成 A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区， B 和 C 区为经初步划线稀释的过渡区， D 区则是关键的单菌落收获区，它 的面积最大， 出现单菌落的概率也最高。 由此可知， 这 4 个区的面积安排应做到 D>C>B>A 。鉴别培养基 是在培养基中加入某种试剂或化学药品， 使难以区分的微生物经培养后呈现 出明显差别， 因而有助于快速鉴别某种微生物

3、。 这样的培养基称之为鉴别培养基。 例如用以 检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。 (参考 GB4789.38-2012 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数) 其配方中含有乳糖、 伊红和美蓝， 用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。 伊红、 美蓝作为指示剂， 伊红系酸性染料， 当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时， 由于细菌带正电荷， 所以 被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色， 且具有绿色金属光泽； 菌落呈棕色者为产气肠杆菌； 不分解乳糖的肠道病原菌则不着色， 有 时因产生碱性物质较多， 细菌带

4、负电荷， 被美蓝着色后， 菌落并不呈蓝色， 因美蓝与伊红结 合，所以菌落为淡紫色。三、材料和器皿 1、菌种：大肠埃希氏菌 (Escherichia coli )和枯草芽孢杆菌 ( Bacillus subtilis )的混合培养斜 面菌种。2、培养基：伊红美监琼脂培养基 3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。四、实验步骤1、融化培养基将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。2、倒平板待培养基冷却至50 C左右后，按无菌操作法倒平板（每皿约倒15ml），平置，待凝。操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰

5、；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平 置于桌面上，待凝后即为平板。3、作分区标志（操作熟练后此步骤可省略）在皿底用记号划分成 4个不同面积的区域，使 A<B<C<D，且各区的夹角应为 120。左 右，以便使D区与A区所划出的线条相平行、美观。（图1）图1平板分区、线条和划线操作示范示意图4、划线操作1）挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。2）先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰

6、。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划34条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。B区转至划线位置，3）划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使 把接种环通过 A区（菌源区）而移至B区，随即在B区轻巧地划上67条致密的平行线，接 着再以同样的操作在 C 区和 D 区划上更多的平行线，并使 D 区的线条与 A 区平行 （ 但不能 与 A 区或 B 区的线条接触！ ） ，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。5、恒温培养将划线后的平板至 37 C倒置培养23天。6、挑单菌落良好的结果应在 C 区出现部分单菌落，而在 D 区出现较多独立分布的单菌落。然后从 典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。7、清洗培养皿 将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。五、注意事项1、平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培 养基温度不能太高。2、 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2% 左右），否则会因平板太软而被划破。3、 用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm ），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间 的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。4、 为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4 区，并用接种环练习划 线动作，待通过模拟试验熟练操作