荭草提取物肠外翻吸收探究

1、茲草提取物肠外翻吸收探究摘要利用肠外翻模型研究茲草提取物不同剂量 在大鼠不同肠段的体外肠吸收特征。采用uplc-ms/ms检测 不同肠段中原儿茶酸，异茲草素，茲草素，牡荆素，木犀草 昔，楣皮昔及山奈素鼠李糖昔含量，比较茲草提取物中各化 学成分在各肠段的吸收情况，并计算提取物中各成分的吸收 参数，用spss 13.0统计学软件对数据进行分析处理，分析 考察对吸收参数影响的显著性，进一步分析其在不同部位的 吸收特征。茲草提取物不同浓度时原儿茶酸等7种成分在不 同肠段的吸收均为线性吸收，其回归相关系数（r2）均大于 0. 95,符合零级吸收速率，肠吸收速率（ka）随着茲草提 取物浓度增加呈线性增加（

2、r2>0.95）,表明各成分以被动扩 散机制吸收；所考察成分在不同肠段肠囊的吸收速率存在不 同程度的差异，各成分在各肠道的吸收趋势为十二指肠、空 肠、回肠大于结肠。肠囊对茲草中化学成分的吸收透过有选 择性，外翻肠囊法可评价其多成分的肠吸收特性。关键词茲草；肠外翻；吸收；uplc-ms/ms；吸收速 率常数收稿日期2014-01-04基金项目国家自然科学基金项目（81360664）；贵 州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字201115081,黔科合重 g 字2013 4001)通信作者黄勇，副教授，tel: (0851) 6908899,e-mai1: mailofhy12

3、6 com作者简介刘跃，硕士研究生,tel:e-mail： liuyue_25215126 com茲草为蓼科植物茲草polygonum orientale l.的干燥 全草，为贵州省地产药材，收载于贵州省中药材质量标准 1988年版1,具有祛风利湿，活血，消积，止痛等功效，s3临床用于风湿性关节炎，冠心病，心胃气痛等2。课题组 前期对茲草做了大量研究报道3-5,但其吸收机制及药效 物质基础的研究还不够完善，基于“入血成分才可能是有效 成分”的假说，本文采用大鼠肠囊外翻模型6-7,对茲草 提取物透过肠壁的可被吸收成分进行分析，研究茲草提取物 中各化学成分在不同肠段的吸收

4、情况，有利于进一步明确其 药效物质基础，并为茲草药物制剂剂型的研究提供理论依据 与基础。1材料 1.1仪器waters超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（acquity uplc系统，masslynx v4. 1工作站，包括二元高 压梯度泵、自动进样器、电喷雾电离源等）；allegra64r低 温高速离心机（美国beckman coulter公司）；mtn-2800d氮 吹浓缩装置（奥特塞恩斯仪器公司）；超纯水机（四川沃特 尔科技发展有限公司）；自制麦氏浴管；混合气体（95%02, 5%c02）； dk-98-iia恒温水裕锅（天津泰斯特仪器有限公司）。1.2试剂葛根素（批号0752-9

5、605）、原儿茶酸（批号809-200102） 对照品购自中国食品药品检定研究院；异茲草素、茲草素、 牡荆素、木犀草昔、桝皮昔、山奈素鼠李糖昔对照品自制（纯 度$98%）；茲草提取物（批号090618）；盐酸维拉帕米（阿 拉丁）；甲醇（hplc级，天津科密欧化学试剂有限公司）；乙 月青（hplc级，德国merck公司）；实验用水为超纯水；其余 试剂均为分析纯。tyrode 液：称取 nacl 8. 0 g, kc1 0. 2 g, cac12 0. 2 g, nahc03 1.0 g, nah2p04 0. 05 g, mgc12 0. 1 g, 葡 萄糖l.og,加蒸馆水溶解后与溶解的cac

6、12及葡萄糖混匀, 蒸馆水定容至1l即得。1.3动物健康sd大鼠，雄性，体重为（250±20） g,由贵阳医 学院动物中心提供，批号scxk （黔）2002-000k2方法与结果2. 1分析条件色谱条件如下owatersbehc18色谱柱（2. 1 mmx 100 mm, 1. 7 u m）； waters van guard beh c18 保护柱（2. 1 mmx5 mm, 1. 7 um),流动相为0.1%甲酸乙睛(a) -0. 1%甲酸水(b), 梯度洗脱(0-0. 5 min, 15% a； 0.5-0. 8 min, 15%20% a； 0. 83 min, 20%25%

7、 a； 34 min, 25%90% a； 45 min, 90%15% a),流速 0. 30 ml min-1,柱温 45 °c, 进样体积为2 ulo质谱条件：采用电喷雾电离源(esi),毛细管电离电压 3 kv,离子源温度120 °c ；喷雾气与反吹气为氮气，去溶 剂气流速650 l hr-1,扫描方式为多反应离子监测(mrm), 用于定量分析的原儿茶酸，异茲草素，茲草素，牡荆素，木 犀草昔，桝皮昔，山奈素鼠李糖昔及葛根素(内标)监测离 子反应分别 m/z 152.8/109.0； m/z 449. 2/299. 1 ； m/z 449. 2/329. 2 ； m/

8、z 433. 2/313.0； m/z 449. 2/287. 1 ； m/z 449. 2/303.1； m/z 433. 2/287.1； m/z 417. 0/267. 0o2.2标准溶液的配制精密称取原儿茶酸，异茲草素、茲草素、牡荆素、木犀 草昔、桝皮昔、山奈素-鼠李糖和葛根素适量，用甲醇配制 成原儿茶酸(1.202 gl-1)、异茲草素(0.946 gl-1)、 茲草素(0. 844 g l-1)、牡荆素(0. 816 g l-1)、木犀草 昔(0.856 g l-1).楣皮昔(1.200 g l-1)和山奈素-鼠 李糖昔(1.210g l-1)的储备液，置冰箱(-20 °

9、c)保存, 备用。分别精密量取原儿茶酸等7种对照品储备液适量， 48 £下氮气吹干，用空白tyrode液溶解后按梯度稀释成所需浓度，得混合系列标准溶液。2.3方法学考察2. 3. 1专属性试验 比较空tyrode液、混合对照品溶液 和茲草供试液的色谱行为，在建立的色谱条件下考察其专属 性。原儿茶酸等7种成分及葛根素(内标)的保留时间(tr) 分别为 1.27, 1.5, 1.92, 2. 03, 2. 32, 2.48, 2. 95, 3. 66 min, 空白肠液无干扰，见图lo2. 3.2线性关系的考察 取混合系列溶液各100 ul,按 2.4项下操作，建立标准曲线。以待测物的峰

10、面积与内标峰 面积之比(a/ai)为纵坐标y,各物质浓度(c)为横坐标x 进行直线回归，权重系数为1/x,计算标准曲线回归方程和 相关系数。原儿茶酸(y二0. 136x+0. 006 1, r2=0. 999 4, 0. 049 5-36. 06 mg l-1),异茲草素(y二0. 172x+0. 065 7,r2=0. 994 5, 0.415 2302. 7 mg l-1),茲草素(y二0. 252x+0. 106 4, r2二0. 991 7 , 0.370 5 270. 1 mg l-1 ),牡荆素(y=0. 320x+0. 028 4, r2=0. 995 5, 0.145 5106

11、. 1 mg - l-1),木犀草 (y=0. 480x+0. 003 6, r2=0. 999 6, 0. 058 7 42. 80 mg l-1),桝皮昔(y=0. 367x+0. 013 3, r2二0.999 6, 0.115 284.00 mg l-1 ), 山奈素鼠李糖昔(y-0. 510x-0. 005 0, r2二0.999 5, 0.016 612. 10 mg - l_1 )o2. 3.3回收率试验 按2. 3.2项下操作，分别配制高， 中，低3个浓度的原儿茶酸等7种成分的溶液，每个浓度平 行配制5份，将测得的原儿茶酸等7种成分的a/ai代入标 准曲线方程，以测得量与加入量

12、之比计算方法回收率，结果 在92. 58%104. 9%,符合生物样品分析要求。2. 3.4精密度试验按2. 3.2项下操作，分别配制高， 中，低3个浓度的原儿茶酸等7种成分的溶液，每个浓度平 行配制5份，算日内精密度，结果均w13.58%； 3种浓度连 续测定5 d,计算日间精密度，结果在1.35%12. 65%,符 合生物样品分析要求。2. 3.5稳定性试验 按2. 4项下方法处理肠吸收液样品, 分别于0, 2, 4, 6, 8, 12 h取样分析，原儿茶酸等7种成 分的rsd均0. 95),表明各成分以被动扩散机制吸收。而从 统计结果可知肠囊对各成分的吸收具有浓度及肠段依赖性， 结肠对原

13、儿茶酸等成分的吸收较其余肠段慢，统计学有显著 性差异(p结肠。可看出茲草提取物中不同成分在肠囊中的 吸收具有较大差异，这可能是各成分不同的化学结构所致。3讨论本实验采用外翻肠囊模型，建立了 uplc-ms/ms测定茲草外翻肠囊样品中7个有效成分含量，其方法快速、简便, 能显著提高定量分析的重复性和可靠性以及定性分析的准 确性11,可成功应用于茲草提取物中有效成分的肠道吸收 动力学研究，为茲草药物制剂剂型的研究提供理论依据与基础。实验还考察了 p-gp抑制剂对吸收的影响，通过 在供试药液中加入p-gp抑制剂维拉帕米(100 u mol lt), 对q和ka进行方差分析，结果显示原儿茶酸等各成分在

14、不 同肠段中均无显著性差异，表明茲草提取物中原儿茶酸等7 种成分可能不是p-糖蛋白的底物。本实验结果表明原儿茶酸、异茲草素、茲草素、牡荆素、木犀草昔、柳皮昔、山奈素鼠李糖昔均能较易透过肠黏膜； 课题组前期对茲草的入血成分进行了相关研究12,研究结 果表明口服茲草提取物后，能发现5种原型吸收入血的成分, 其余成分未能检测到，可能与其在提取物中含量较低及检测 灵敏度有关。2种手段研究茲草提取物吸收成分存在较好的 对应关系，通过检测离体外翻肠囊实验大致推测能在体吸收 入血的成分，实现快速寻找中药或中药复方药效物质基础之 目的。参考文献1 贵州省卫生厅.贵州省中药材质量标准m.贵 阳：贵州人民卫生出版

15、社，1990： 6.2 王爱明，王永林，刘丽娜，等.茲草药材的质量研究j中国中药杂志，2006, 31(13)： 1047.3 李勇军，何迅，刘丽娜，等.茲草化学成分的研究 j.中国中药杂志，2005, 30 (6)： 444.4 王爱民，迟明艳，王永林，等.uplc同时测定茲草 药材中8种指标成分的含量j中国中药杂志，2010, 35(13)： 1723.5 黄勇，何峰，郑林，等.uplc-ms/ms同时测定beagle犬血浆中原儿茶酸、异茹草素和野黄苓昔j.中国药理学通 报，2011, 27(5)： 716.6 hg沃格尔，wh沃格尔.药理学实验指南一一新药 发现和药理学评价m.杜冠华等译

16、北京：科学出版社， 2001： 661.7 祝诚诚，何新.药物肠道吸收研究方法j.药物评价研究，2010, 3(33)： 222.8 黄斌，李耿，郭宇飞，等.脑心通胶囊中4个成分 肠吸收研究j中国中药杂志，2013, 38 (6)： 889.9 龚慕辛，王雅，宋亚芳，等.外翻肠囊法快速发现吴茱萸汤吸收成分群的研究j.中国中药杂志，2010, 35(11)： 1399.10 宋蓿，朱晶晶，王维皓，等.semac快速发现龙胆 吸收成分群的研究j.中国中药杂志，2012,37 (7)： 969.11 yamashita t, dohta y, nakamura t, et al.high-speed

17、 solubility screening assay using uplc/ms/ms in drug discovery j j chromatogr a, 2008,1182 (1 )：72.12 王永林，陈慧，郑林，等.茲草的血清药物化学初步研究j中国医院药学杂志，2013,33(13)：1100.absorption of extractive polygonum orientale in rat everted gut sacsliu yue, tang li, cao xu, zheng lin, wangai-min, huang yong(1. guizhou provinc

18、ial key laboratory of pharmaceutics, school of pharmacy, guiyang medical college, guiyang 550004, china；2. engineering research center for the development and application of ethnic medicine and traditional chinese medicine,ministry of education, guiyang medical college, guiyang 550004, china)abstrac

19、t using in vitro everted gut to investigate the intestinal absorption of the extracts from polygonum orientale at different concentra/tiori. uplc-ms/ms was used to detect the content of protocatechuic acid, isoorientin, orientin, vitexin, cynaroside , quercitrin , kaempfero1-rhamnoside in different

20、intestinal segments , then compared the results with the absorption of chemical components of extractive p. orientale in each intestinal segments，and calculated the absorption parameter we took the statistic analysis with spss statistic software the influence significance of each factors were analyzed to describe the character of absorption. the absorption of each component is linearity in different intestinal segments and different dose , and the square of coeficient correlatio