中国医学科学院阜外心血管病医院ppt课件

1、中国医学科学院 阜外心血管病医院 任晓庆干细胞治疗心律失常 运用、问题与展望v干细胞研讨被杂志评为世界十大科技成果之一v如今每年大约有4000余篇关于干细胞研讨的论文在国际杂志上发表干细胞治疗心律失常干细胞治疗心律失常研讨成为热点研讨成为热点干细胞在心律失常的运用干细胞在心律失常的运用v构建生物起搏构建生物起搏器器vSSSvAVBv重建房室传导重建房室传导通路通路v AVB构建构建生物生物起搏起搏器器第一部分第一部分20012001年，心脏起搏器与因特网年，心脏起搏器与因特网分获美国国立工程院最高奖分获美国国立工程院最高奖 为为什什么么要要构构建建生生物物起起搏搏器器-Dr. S. Furma

2、n (1960, NY)起搏器治疗效果已得起搏器治疗效果已得到世界公认与一定到世界公认与一定一、电子起搏器的缺乏v诸多并发症v感染v出血v心肌穿孔v起搏器功能妨碍v电池耗竭需定期改换v右心室心尖起搏，不符合生理，可引起心功能恶化v心思负担：儿童和青少年生物起搏器应具备特点生物起搏器应具备特点终身产生稳定的生理节律不对机体产生有害作用缓慢性心律失常的治愈缓慢性心律失常的治愈无诱发肿瘤、免疫排斥不需反复移植二、生物起搏器的特点二、生物起搏器的特点构建构建生物生物起搏起搏器的器的方法方法第二部分第二部分3.添加舒张期内向电流4.将干细胞或体细胞调控为自律细胞2.降低细胞复极电流构建构建生物生物起搏起

3、搏器的器的方法方法1.上调细胞肾上腺能活性5.将干细胞转染起搏基因上调细胞肾上腺能活性1 1转转染染肾肾上上腺腺能能受受体体基基因因 动物实验动物实验动物实验vEdelberg等在 1998年把人的2受体基因转染到大鼠的心脏，使其过度表达，结果大鼠的心率添加了 402受体基因质粒心率添加40动物实验vEdelberg等在 2001年把人的2受体基因质粒注射到猪的右心房，48小时后出现心房节律，此节律心率添加了 50对肾上腺能刺激起反响，心率添加502受体基因质粒意义v使心室肌或心房肌细胞的逸搏频率增快v可治疗窦房结病变或房室传导阻滞降低细胞膜静息电位复极电流2 2Ik1内向整流电流窦房结细窦房

4、结细胞胞心室肌细心室肌细胞胞Ik1内向整流电流2002、2003年 Miake在 NatureIk1编码基因是Kir2.1重组基因重组基因Kir2.1AAAKir2.1AAA抑制抑制心室肌细胞转心室肌细胞转变为类窦房结变为类窦房结自律细胞自律细胞本实验结论本实验结论v降低静息电位，可使内向电流启动而触发起搏v抑制Ik1可使心室肌细胞转换为起搏细胞v细胞内定位转染Kir2.1AAA可以建立生物起搏点，以到达治疗目的v此技术存在的问题：可产生局灶异位自发节律，与心室节律竞争3 33.添加舒张期内向电流起搏电流，If电流建立起搏电流If电流vIf电流的基因编码为HCN,3个亚基在心脏HCN1,HCN

5、2,HCN4v转染HCN基因可将普通细胞改动为起搏细胞动物实验vQu等在 2003年把包含HCN2的腺病毒注射到犬左房内HCN2基因腺病毒v注射点出现心房节律v此处心肌细胞的If电流强100倍动物实验vPlotnikov等( 2004年)导管法将HCN2腺病毒颗粒注射到犬左束支内v注射点出现稳定的自发心室异位节律，60bpmv注射点HCN高度表达HCN2腺病毒颗粒细胞移植细胞移植4 4异体细胞移植vRuhparwar 将胎犬心房肌细胞包含窦房结移植到成年犬的左心室游离壁v移植细胞成为受体心脏新的起搏点v供体细胞和受体细胞之问建立间隙衔接v起搏点对异丙肾上腺素起反响Rllhparwar A，et

6、 a1Eur J Cardiothorac surg.2002；21：853857动物实验v采用酶消化法分别新生约克夏猪右心房采用酶消化法分别新生约克夏猪右心房组织组织(包括窦房结包括窦房结)v制备成制备成5l0 个个mL心肌细胞悬液心肌细胞悬液v开胸直视下将开胸直视下将l mL悬液注入幼年猪左心悬液注入幼年猪左心室游离壁室游离壁v移植细胞均成活，并与周围心肌发生电移植细胞均成活，并与周围心肌发生电、化学衔接，主导心室节律、化学衔接，主导心室节律v对异丙肾上腺素发生反响对异丙肾上腺素发生反响动物实验动物实验Cai J，et a1Transplanted neonatal cardiomyocy

7、tes as apotential biological pacemaker in pigs with complete atrioventricularblockTransplantation，2006，81(7)：10221026v男性人胚胎心房肌细胞(窦房结细胞)移植到雌性猪左室壁v细胞移植后动物心室率较未进展细胞移植的快v电生理阐明心室节律起自细胞移植区：vPCR检测证明细胞移植区出现SRY基因v在移植细胞与宿主细胞之间出现了衔接蛋白43动物实验动物实验Lin G，et a1Biological pacemak er created by fetal cardiomyocyte tra

8、nsplantationJ Biomed Sci，2005，l2(3)：513_519异体细胞移植存在的问题异体细胞移植存在的问题v有异体排斥反响；有异体排斥反响；v 移植的胚胎体细胞对异体移植部移植的胚胎体细胞对异体移植部位的微环境顺应性差；位的微环境顺应性差；v供体细胞来源困难供体细胞来源困难5.将胚胎干细胞调控为起搏细胞5 5vSatin等研讨人等研讨人ESC分化的心分化的心肌细胞，其药理敏感性和离肌细胞，其药理敏感性和离子通道特性，发现该细胞具子通道特性，发现该细胞具有自发的起搏兴奋特性，可有自发的起搏兴奋特性，可作为心脏起搏细胞作为心脏起搏细胞Satin J，et a1J Physi

9、ol，2004，559：479-496动物实验动物实验vKehat用人用人ESC在体外培育出心肌细胞移在体外培育出心肌细胞移植物，与体外培育的大鼠心肌细胞之间建植物，与体外培育的大鼠心肌细胞之间建立了电立了电-机械联络机械联络v用猪建立了一个完全型房室传导阻滞模型用猪建立了一个完全型房室传导阻滞模型v将培育的心肌细胞移植入受体心脏，可察将培育的心肌细胞移植入受体心脏，可察看到受体和供体的电一机械交融看到受体和供体的电一机械交融v移植细胞能胜利使心室节律性起搏移植细胞能胜利使心室节律性起搏动物实验动物实验Kehat I，et a1Nat Bio technol，2004，22(10)：1282-

10、1289vXue等 将人胚胎干细胞修饰为起搏细胞v在体外使静止的心室肌细胞产生节律性的电一收缩活动vB肾上腺素、利多卡因等药物能调控其跳动速度v将这些细胞注射到豚鼠左室前壁，即能驱动心室搏动，构成起搏点Xue T，et a1Circulation，2005，111：11-20动物实验优势优势v胚胎干细胞为全能干细胞，具有建系传代、全能分化、干细胞永生化、增殖才干强等方面优势 问题v一、胚胎干细胞具有向终末细胞分化的特性，而分化为终末细胞那么失去起搏特性。因此准确控制干细胞分化并终止于窦房结细胞阶段是一个绝技v二、尚不清楚具备起搏功能的胚胎干细胞，能否具有人类心脏起搏细胞同样的离子通道限制限制v

11、社会伦理问题v胚胎干细胞具有致心律失常源性v胚胎干细胞具有免疫源性 v致肿瘤性6 66.将间叶干细胞构建为生物起搏器骨髓骨髓间叶间叶干细干细胞移胞移植构植构建生建生物起物起搏器搏器方法一方法一动物实验动物实验优点v间叶干细胞容易分别培育v多系分化增殖v无免疫排斥 v不存在伦理问题v易于分化诱导为自律细胞实验实际根底实验实际根底v间叶干细胞具备起搏潜能电生理实验v干细胞间高度表达特异性缝隙衔接蛋白Cx40和Cx43v细胞电生理和染料传送dye-transfer实验阐明干细胞之间、干细胞与心肌细胞之间存在偶联(couple)景象v动物实验阐明，干细胞之间、干细胞与宿主心肌细胞之间建立Cx43缝隙衔

12、接(gap junction) 首先培育骨髓间叶干细胞病窦模型制造手术室及射频仪与多导心电记录仪病窦模型制造将诱导干细胞移植于窦房结区开胸，暴露窦房结区骨髓干细胞移植后动物窦房结功能改善，心率由110bpm添加到170bpm对照组犬窦房结功能未见改善，心率未恢复至170bpm,注射阿托品未见心率添加对照组窦房结功能未见改善注射阿托品未见心率添加对照组血管密度低，未见BrdU标志细胞骨髓干细胞移植区可见BrdU染色阳性新生心肌细胞免疫组化研讨BrdU染色阳性的新生细胞Troponin I 阳性移植区可见较多新生血管，其内皮细胞BrdU阳性，阐明新生血管内皮细胞来源于骨髓细胞免疫组化研讨移植骨髓细

13、胞其Cx 43染色阳性，阐明骨髓分化细胞建立了缝隙衔接 免疫组化研讨结论v移植骨髓细胞在体内可分化为典型的心肌细胞与血管内皮细胞v移植骨髓细胞可与宿主细胞建立缝隙衔接v移植细胞可替代损伤的窦房结发扬自律起搏功能 v可建立生物起搏器7 7、转、转染起染起搏电搏电流基流基因因HCN HCN 干细干细胞移胞移植构植构建生建生物起物起搏器搏器7 7实验实验 1起搏电流起搏电流v将骨髓干细胞转染HCN和荧光标志GFP，并丈量其起搏电流v铯可以封锁该通道v符合起搏电流If的特性 Potapova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952实验实验 2体外模型体外模型v将装载将装载G

14、FPGFPHCN2HCN2基因干细胞以基因干细胞以点状种植于载玻片上点状种植于载玻片上v其周围种植新生大鼠心室肌细胞其周围种植新生大鼠心室肌细胞v建立以干细胞为中心，心肌细胞建立以干细胞为中心，心肌细胞在周围的类似窦房结样构造在周围的类似窦房结样构造Potapova I, et al. Circ Res, 2004; 94: 952在装载在装载HCN2HCN2干干细 胞 周 围 的细 胞 周 围 的心 肌 细 胞 ，心 肌 细 胞 ，其 自 发 搏 动其 自 发 搏 动节 率 明 显 快节 率 明 显 快于 对 照 组 的于 对 照 组 的节率节率Potapova I, et al. Circ

15、 Res, 2004; 94: 952v将装载起搏基因的间叶干细胞直接将装载起搏基因的间叶干细胞直接点状注射到犬左室心外膜点状注射到犬左室心外膜v注射装载注射装载HCN2+GFPHCN2+GFP干细胞的犬有自干细胞的犬有自发心室节律，频率大约发心室节律，频率大约60bpm60bpm，起搏，起搏点位于注射部位点位于注射部位v在注射点可检测到装载荧光标志在注射点可检测到装载荧光标志GFPGFP的成人间叶干细胞的成人间叶干细胞v证明移植干细胞之间、干细胞与宿证明移植干细胞之间、干细胞与宿主心肌细胞之间构成了缝隙衔接主心肌细胞之间构成了缝隙衔接实验实验 3体内模型体内模型Potapova I, et

16、al. Circ Res, 2004; 94: 952构建构建房室房室传导传导通路通路-处理处理房室房室阻滞阻滞第三部分第三部分移植干细胞组织工程技术v实验一 干细胞移植治疗房室传导阻滞vXiaoqing Ren, et al. Cardiac atrioventricular conduction improved by autologous transplantation of mesenchymal stem cells in canine atrioventricular block models. J Geriatr Cardiol, 2007, 4(4): 238-243.1 1移

17、植分化的间叶干细胞重建房室传导射频消融制备三度房室阻滞模型射频消融制备三度房室阻滞模型将诱导干细胞移植于房室结区干细胞移植可改善房室传导干细胞移植可改善房室传导v干细胞移植后房室传导功能改善v干细胞在房室结区分化为心肌细胞与血管内皮细胞v干细胞与宿主细胞建立缝隙衔接v移植干细胞具备电传导功能v实验二 组织工程技术重建房室传导功能vChoi YH, et al. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 2006 ;169(1):72-852 2组织工程技术组织工程技术重建房室传导功能组织工程技术重建房室传导功能v分别和

18、培育大鼠成肌干细胞v制备三维构造的组织工程移植物222mm组织工程技术重建房室传导功能组织工程技术重建房室传导功能v开胸将三维组织工程移植体缝埋到动物房室沟内v移植体内的干细胞具有缝隙衔接功能v组织工程移植体具备电传导功能结论v移植干细胞可与宿主细胞建立缝隙衔接，具备传导功能v移植干细胞可替代损伤的房室结发扬传导功能 v分化干细胞移植或组织工程技术改善、重建房室传导功能，有望取代电子起搏器第四部分第四部分细胞细胞移植移植存在存在的问的问题题1、异体细胞移植存在的问题、异体细胞移植存在的问题v有异体排斥反响；有异体排斥反响；v 移植的胚胎体细胞对异体移植部移植的胚胎体细胞对异体移植部位的微环境顺应性差；位的微环境顺应性差；v供体细胞来源困难供体细胞来源困难2、胚胎干细胞移植存在的问题、胚胎干细胞移植存在的问题v社会伦理问题v致心律失常源性v具有免疫源性 v致肿瘤性3、骨髓干细胞移植存在的问题、骨髓干细胞移植存在的问题v移植骨髓干细