液态活检在肿瘤临床研究中的应用PPT课件

1、液态活检在肿瘤临床研究中的应用吴守信 博士 医学副总监上海张江转化医学研发中心上海宝藤生物医药科技股份有限公司2017.07.260传统肿瘤诊断1传统肿瘤诊断技术 病理检验诊断影像学检测病理组织检查 （HE，IHC）血清标志物检测 （CEA,PSA)核磁共振成像（MRI）正电子成像术（PET-CT）X射线断层扫描术（XRAY,CT）超声波检测（B超）内窥镜（Endoscope）分子病理检测 （FISH, RT-PCR, NGS）血清标志物：较灵敏，但特异性不足，有些癌症没有合适的血清标志物影像学：较灵敏，特异性不足，对病灶大小有要求；结果普遍存在滞后性病理学：金标准，取样会带来创伤和扩散风险，

2、很多晚期患者无法取样或取样不足液态活检 快速、简便、无创伤的检测方法 2Rolfo C, et al. Biochim Biophys Acta. 2014; 1846(2): 539-46.2015年度十大突破技术液态活检技术光荣上榜2016福布斯：未来五年改变医疗行业的五项技术免疫疗法：检查点、CAR-T人工智能：智能辅助诊断液态活检：肿瘤无创检测CRISPR/Cas9：药品研发3D打印：器官、组织修复科学美国人与世界经济论坛联合发布了2017年全球十大新兴技术，液态活检位列榜首液态活检标志物3Siravegna G, et al. Nat Rev Clin Oncol. 2017.CTC

3、s来自抗凝的外周全血，完整的肿瘤细胞一般认为源于原发灶/转移灶活细胞、不宜长期保存细胞学形态、结构分析；DNA，RNA，蛋白质等具有一定的病情评价、预后判断，早期诊断潜力ctDNA来自抗凝的外周血血浆，片段化的DNA片段肿瘤细胞凋亡/坏死释放的片段提取纯化后的核酸，可以保存DNA突变监测，甲基化等DNA修饰相关分析用于个体化治疗，早期诊断潜力相对明确外泌体直径30-120nm的膜性囊泡，由肿瘤细胞分泌进入体液内含物为蛋白质、mRNA、miRNA分析外泌体数量、大小、内含物组成具备可挖掘的诊断和预后潜力循环肿瘤细胞（CTCs）1869: 首次发现Ashworth首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血

4、液循环的肿瘤细胞，并率先提出了CTCs的概念。1889: 种子与土壤学说Paget提出了 “种子和土壤”的学说，强调癌细胞和微环境之间的关系。1976： Nowell修正定义来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。2003: Shook, Keller发现上皮间充质转化CTC关键概念才得以阐述。EMT使上皮细胞丢失上皮细胞的表型，获得某些间质细胞的表型，从而有能力入侵通过周围的基底膜。2004：FDA批准cell search应用于临床2013: Heitzer利用单细胞测序技术发现CTC与原发或转移肿瘤组织存在相同的基因变异谱，为CTC作为肿瘤替代

5、性样本奠定了最终的基础。2014：宝藤引进SET-iFISH系统，立志为中国的CTC临床应用做出贡献。4CTCs检测技术原理富集：免疫纳米磁珠富集上皮来源的细胞鉴定：CD45和CK8/18/19荧光抗体与DAPI共同识别CTC为：EPCAM+CK+DAPI+CD45-富集：阴性富集，去除血源性白细胞、红细胞及血浆蛋白鉴定：FISH探针（鉴定多倍体）白细胞标志物（CD45）肿瘤特异标志物（CK，HER2等）DAPI根据临床需要灵活添加其他肿瘤标志物CellSearchiFISH-CTC抗EpCAM纳米磁颗粒 CTC细胞 FDA批准的临床应用2004年、2007年、2008年分别批准用于转移性乳腺

6、癌、结直肠癌、前列腺癌的预后评估、PFS和OS预测；转移性乳腺癌：CTC5，预后不良CK-CTCCK+CTCCTC聚体5CFDA批准试用于多种实体瘤iFISH-CTC检测技术特色富集到的非血源性细胞处于生存状态，可用于后续一系列相关研究可进行后续研究03免疫荧光染色结合FISH技术进行非血源性细胞染色体异常检测，细胞形态展现好，特异性更强，能更准确地鉴定肿瘤细胞可进行染色体异常检测02EPCAM磁珠富集法只能检测上皮来源的肿瘤细胞，iFISH-CTC的富集过程不依赖细胞表面标志物，通用于多种类型CTC的分离不局限于上皮来源肿瘤01细胞培养 单细胞基因组分析 蛋白组学分析6CTC的科研临床转化临

7、床应用辅助诊断：早期诊断；预测转移实时监控：肿瘤进展监控；治疗反应监控；复发监控预后评估。科研探索诊断相关：细胞表面标志物的替换发病机制：单细胞测序发现新的突变基因。乳腺癌/胃癌的CTC亚型- Her2CTC在临床早期预测肿瘤发生及转移预测耐药及复发7 ctDNA（circulating tumor DNA），即循环肿瘤DNA，从字面意思来讲，指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。但是在了解ctDNA之前，我们要知道另一个与之相关的概念cfDNA。 cfDNA（cell-free DNA），或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿

8、瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒DNA）。 来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞2、来自于凋亡的肿瘤细胞3、来自于肿瘤细胞分泌的外排物循环肿瘤DNA特点血液中ctDNA含量低具有与肿瘤自身相同的基因改变2014易瑞沙（Iressa）血液ctDNA伴随诊断获欧盟批准欧洲药品管理局（EMA）批准易瑞沙（Iressa）标签II型变化更新，使ctDNA检测方法成为医生评估EGFR突变状态的重要方法之一。20162015 CFDA更新易瑞沙说明书晚期或转移性NSCLC患者的一线治疗时，如果肿瘤标本不可评，则可使用从血液（血浆）标本中获得的循环肿瘤DNA(ctDNA)。2017 更多应用：更多应用：ct

9、DNA 结合二代测序、数字PCR监控各类型肿瘤发生发展ASCO: 发布有史以来发布有史以来最大规模的最大规模的ctDNA检测检测研究研究15191名患者的17628份血液样品进行了ctDNA检测，涉及50种肿瘤类型。结果发现，血检肿瘤DNA的敏感度分别能达到86%（肺癌），83%（乳腺癌），85%（结直肠癌）和78% （其他类型肿瘤）。8ctDNA检测技术平台 在传统的PCR扩增前 对样品进行微滴化处理 高灵敏度、高特异性ctDNA检测基因重测序NGSddPCR技术 基因和位点覆盖度广、可自由订制可调节测序深度ddPCR技术特色通量高、覆盖度广。可根据测序深度调节检测灵敏度。可发现未知突变。N

10、GS技术特色9FDA批准的临床应用2016年6月1日FDA批准了第一个基于血液样本的基因检测技术，该技术能够从非小细胞癌患者（NSCLC）的血液中直接检测表皮生长因子受体（EGFR）基因突变。ctDNA的科研临床转化实时监控肿瘤复发与转移监控患者对治疗的反应早期判断肿瘤原发灶评估基因突变频率 判断预后健康人10外泌体 Exosomes外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后， 释放到细胞外基质中的一种直径约 30120nm 的膜性囊泡。特点直径约 30120nm；广泛分布于血浆、乳汁、唾液、尿液、脑脊髓液等体液中；来源广泛：T 细胞、 B 细胞、血小板、树突状细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他

11、非血源性细胞都会分泌 exosome；携带具有生物活性的多种蛋白质、mRNA、miRNA；参与细胞通讯、细胞迁移等过程。11外泌体检测技术平台 经典、金标准 费时外泌体分离试剂盒提取超速离心法 产品线丰富 操作简单 省时12外泌体检测方法及研究策略13超速离心法密度梯度离心超滤离心磁珠免疫法PEG-base沉淀法试剂盒提取Exosome Diagnostic临床外泌体检测方法透射电镜蛋白分析新一代测序分析表达差异分析和功能探索外泌体研究策略基于血液：肺癌基于尿液：前列腺癌San Lucas FA, et al. Ann Oncol. 2016; 27(4): 635-41.拷贝数、点突变、插入

12、、缺失、融合Exosome的科研临床转化肿瘤的早期诊断肿瘤的转移参与肿瘤的发生与发展Kalluri R. The biology and function of exosomes in cancer. J Clin Invest. 2016;126(4):1208-1215.14液态活检在癌症中的临床应用 早期诊断 指导用药 疗效监控15 复发、转移预测 预后评估 机制探索MCTA-Seq可将大部分癌组织与非癌组织区别开来，并于癌组织中识别出866个高度甲基化的CGIs。Wen L, et al. Cell Res. 2015, 25: 1250-64.16 早期筛查 基于对cfDNA的测序可

13、发现异常表达的甲基化序列，进而对HCC早期筛查小肝癌（3cm）中有382个差异表达的甲基化的位点，并识别了一系列肝癌早期筛查的标志物。Wen L, et al. Cell Res. 2015, 25: 1250-64.17 早期筛查 基于对cfDNA的测序可发现异常表达的甲基化序列，进而对HCC早期筛查两类标志物用于区别肝细胞癌及肝硬化等非癌疾病均具有较高的特异性和敏感性Wen L, et al. Cell Res. 2015, 25: 1250-64.第一类标志物第二类标志物18 早期筛查 基于对cfDNA的测序可发现异常表达的甲基化序列，进而对HCC早期筛查结论：该研究指出通过Methyl

14、ated CpG tandems amplification and sequencing (MCTA-Seq)这种测序方法，可以更有效的发现cfDNA甲基化的生物学标志物，有望完善临床上对癌症的筛查。Wen L, et al. Cell Res. 2015, 25: 1250-64.19 早期筛查 基于对cfDNA的测序可发现异常表达的甲基化序列，进而对HCC早期筛查Li J, et al. Oncotarget. 2016, 7: 2646-59. 肿瘤组织及CTC的pERK/pAkt表型基本一致20 指导用药 基于对CTC pERK及pAkt表达的检测可指导索拉菲尼用药Li J, et

15、al. Oncotarget. 2016, 7: 2646-59. 影像学显示：一位只有pERK+/pAktCTCs的患者在使用索拉菲尼治疗后肝叶上的肿瘤结节缩小或消失21 指导用药 基于对CTC pERK及pAkt表达的检测可指导索拉菲尼用药Li J, et al. Oncotarget. 2016, 7: 2646-59. 索拉菲尼可以有效减少pERK+/pAktCTCs患者的CTC数量， pERK+/pAktCTCs所占比例越多的患者，其PFS越长黑, pERK+/pAkt+CTCs；红, pERK+/pAktCTCs蓝, pERK/pAkt+CTCs；绿, pERK/pAkt CTCs

16、.22 指导用药 基于对CTC pERK及pAkt表达的检测可指导索拉菲尼用药Li J, et al. Oncotarget. 2016, 7: 2646-59. 有40%pERK+/pAktCTCs的患者，其PFS较长23 指导用药 基于对CTC pERK及pAkt表达的检测可指导索拉菲尼用药Li J, et al. Oncotarget. 2016, 7: 2646-59. 结论：1.索拉菲尼对pERK+/pAktCTCs的患者具有最优的治疗效果。2.通过对CTCs进行表型检测，指出pERK+/pAkt有望作为索拉菲尼治疗肝细胞癌的PFS的独立预测因素。24 指导用药 基于对CTC pER

17、K及pAkt表达的检测可指导索拉菲尼用药25Dawson SJ, et al. N Engl J Med. 2013; 368(13): 1199-209.30例接受系统治疗的转移性乳腺癌患者某患者携带PIK3CA等6个基因点突变，突变基因ctDNA含量随治疗方案和病情进展呈相似改变与肿瘤现有标志物CA15-3和CTCs相比，ctDNA在反映治疗效果和肿瘤负担方面更为敏感 疗效监控 基于对ctDNA的检测：监控乳腺癌肿瘤负担 复发和未复发CRC患者（6例）：miRNA芯片发现外泌体中差异表的miRNA。 qRT-PCR对差异表达miRNA在健康人（6例）和CRC患者人群中验证（90例）.1.m

18、iR-17-92a基因簇在外泌体中的表达水平与结直肠癌的复发相关。2.血浆外泌体中miR-19a在CRC患者中的表达水平显著高于健康人。3.CRC患者血浆中外泌体miR-19a高表达与预后差相关。外泌体中miR-19a与CRC患者的预后（209例）Br J Cancer. 2015 Jul 14;113(2):275-81. 预后评估 基于对外泌体mirRNA的检测：发现预后标志物姓名：xxx 性别：男年龄：45岁 检测项目：肿瘤早期检测样本种类：全血检测时间：如右图检测内容：循环肿瘤细胞检测 循环肿瘤DNA检测循环肿瘤DNA检测循环肿瘤细胞检测CTCCTC检测结果：KRAS 基因突变超标检测

19、结果：循环肿瘤细胞5个影像学检查检测结果：直肠有瘤病理检查结果：良性结直肠腺瘤 20142014年年1212月月1010日日 20142014年年1212月月2626日日突变位点提示：癌灶突变位点提示：癌灶可能在结直肠或胰腺可能在结直肠或胰腺腺瘤的切除手术20152015年年1 1月月3 3日日循环肿瘤 DNA检测 20152015年年2 2月月6 6日日检测结果：KRAS 基因突变下降至正常范围定期随访复查案例分享：案例分享：结直肠癌的临床应用举例-基于对CTC与 ctDNA的检测：发现早期病变部位科研方案小结-癌症早期辅助检查原位癌浸润风险和复发监测 晚期癌症治疗方案选择和疗效监控 疑难性

20、癌抵抗机理研究与新治疗方案实时无创“痕迹”追踪肿瘤负荷变化1 早期筛查2 发病机制探索3 治疗指导4 疗效评估/实时监控5 复发、转移预测6 预后评估。28CTC临床研究思路：监控预后监控进化演化29ctDNA临床研究策略：监控患者药物治疗肿瘤组织和癌旁癌症综合基因panel组测序外周血外周血CTC检测随访预后（CR, PR, PD, SD. OS, PFS）治疗期间采血分析体细胞突变ddPCR检测ctDNA在治疗和随访过程中，以影像学作为疗效判断标准。同时检测肿瘤标志物（AFP等）、细胞因子。关联分析：探索ctDNA的变化与预后、其他指标等的关系30外泌体临床研究策略：发病、转移机制31宝藤科研成果举例合作单位： 本中心与主要合作单