黑曲霉产乳糖酶酶学性质研究

1、黑曲霉产乳糖酶酶学性质研究 班 级：生物工程01班学 号：姓 名： 指导老师： 二零一六年六月摘要乳糖酶（Lactase）的系统名为-D-半乳糖昔半乳糖水解酶，或简称子半乳糖昔酶。利用乳糖酶水解乳糖的能力，生产低乳糖制品（如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等），可以有效解决“乳糖不耐症”问题。用乳糖酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，生产低乳糖制品可以有效消除人体对乳糖的不耐受症状，对于发展我国乳品工业，提高人们的健康水平具有十分重要的意义，这也是目前乳糖酶在食品工业的最大用途之一。关键词：黑曲霉； 乳糖酶 ； 酶学性质目录引言41.1乳糖酶简介41.2在乳品工业中的应用241.3乳糖酶的国内外研究现状及进展5

2、2试验材料62.1试验菌株62.2主要仪器设备62.3实验试剂63.黑曲霉发酵生产73.1试验试剂73.2试验方法74.乳糖酶酶活力和蛋白质含量的测定74.1实验原理74.2试验试剂84.3试验方法84.1.1粗酶液制备85.PH值对乳糖酶活性影响及最适PH值确定105.1.系列缓冲溶液的配制105.2.试验方法116.温度对乳糖酶活性的影响及最适温度确定116.1实验方法116.2结果分析127.蛋白质的层析、洗脱127.1.实验原理127.2.试验方法127.3测定吸光值148.乳糖酶分子量测定-SDS-PAGE电泳法148.1.凝胶配制148.2实验方法148.3 结果分析149展望15

3、引言1.1乳糖酶简介牛奶是最接近完善的营养食品，它包含了人类生长和维持健康的一切营养成分，具有丰富的蛋白质氨基酸和维生素，是天然钙质的极好来源。乳糖是奶类中特有的糖类，也是重要的营养成分之一，该物经小肠粘膜上皮细胞绒毛远端刷状缘上的乳糖酶水解成为半乳糖和葡萄糖后，才能被小肠吸收利用。乳糖酶学名半乳糖苷半乳糖水解酶，又名半乳糖苷酶，是一种白色粉末，无味道，无嗅，溶解后是一种浅棕色液体，乳糖酶通过特定条件水解半乳糖苷键 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，易被肠道吸收。大量研究表明哺乳动物的乳糖酶活性随年龄的增长，具有典型的生理性降低，成人乳糖酶下降的不可逆受基因控制1乳糖不耐症在世界范围内是一种多发疾病

4、，易发人群有以下几种情况：（1）成年人主要是由于遗传原因，体内乳糖酶从出生一年后开始衰减。（2）是先天性疾病。婴儿在刚出生时肠道内就缺乏乳糖酶活性，这将导致严重的肠胃系统失调。（3）由于早产而造成婴儿肠道低乳糖酶活性。（4）蛋白质热值吸收障碍严重的儿童，其乳糖酶活性在一个时期内会暂时消失。乳糖不耐症发生的人种间差别：据悉，70%的成年黑人、10-15%的成年白人、95%的亚洲人受乳糖不耐症困扰。 1.2在乳品工业中的应用2 在20世纪初乳糖酶在乳品工业中的潜力已为人所知，但直至20世纪60年代，当从微生 物中制取乳糖酶进入商品化生产后大规模应用乳糖酶制造低乳糖的乳制品才得以实现。 1.制作低乳

5、糖水解奶：乳糖酶可使低甜度和低溶解度的乳糖转变为较甜的溶解度较大的单糖 （葡萄糖和半乳糖）增加鲜奶的甜度，改善品质，口感。既解决了乳糖不耐受症，又提高了营养价值。 2.在发酵乳品中的应用：可加速发酵效率和反应速度，使不被一般酵母利用的乳糖因水解成葡萄糖而得以利用，增加风味和甜度。 3.在乳清产品中的应用：乳清糖浆可以代替卵蛋白和蔗糖，既减少了糖的用量，又使脱盐乳清粉在食品中的应用量增大，还可促进发酵生色。 4.在甜炼乳中的应用：乳糖酶水解了乳糖，在浓缩时可避免乳糖的结晶现象，使产品细腻，改善品质、可持久保存。 5.在奶粉中的应用：大大提高奶粉的风味和口感、冲调性好、适用人群广、用途多。 在奶酪

6、中的应用：可提高成熟过程，提高奶酪的品质，不仅缩短乳酪凝固时间#而且乳酪凝固坚实 减少乳酪澄清造成的损失。 6.在低聚糖的生产中的应用：乳糖酶通过转糖苷作用生成低聚糖，低聚糖可减少肠道有害毒素的产生，防止便秘和腹泻，有整肠效果、抗癌、降血压、增强肝功能及促进钙吸收等作用。 1.3乳糖酶的国内外研究现状及进展自上世纪60年代以来，科学家们相继发现人体中普遍缺乏乳糖酶.牛乳曾被推崇为天然完全食品，但缺乏乳糖酶的人是不能消化吸收乳糖的，造成乳糖不耐受现象。这一发现受到全世界许多酶学家、微生物学家、医学家以及食品科学家的重视.此后有关乳糖酶的研究进入了一个崭新的时代。在美国、日本和意大利等国己工业化生

7、产固定化的乳糖酶，功能性乳制品一低乳糖制品，并应用于政府实施的“学生奶计划”之中3国内对-D一半乳糖昔酶的研究起步较晚，于20世纪80年代以后才开始对乳糖酶进行研究。到目前为止，已经报道了一些乳糖酶产生菌株，并对酶的分离纯化及酶学性质，诱变育种及产酶优化，酶的固定化及工业应用等方面进行了一定的研究46和其他生物学领域一样，近年来关于乳糖酶分子生物学方面的研究也很多，基因工程技术的发展特别是真核表达系统的发展为乳糖酶的生产展示出广阔的前景，并且目前国内外均有工程菌问世7目前，国外己进入工业化生产乳糖酶阶段，如荷兰Gist-brocades公司生产的商品名为Maxilact的酵母乳糖酶己被用于工业

8、化生产低乳糖乳。而国内，由于菌种酶活力较低，使得乳糖酶的生产至今仍局限于小型实验规模。因此，选育高产菌株，提高乳糖酶的产量已成为棘手的问题82试验材料2.1试验菌株 黑曲霉DL116：生物工程系酶工程实验室提供。2.2主要仪器设备1.电子天平：品牌：奥豪斯， 型号：AR423CN， 准确度等级：， 厂家：奥豪斯仪器（上海）有限公司， 产品标准号：Q/SGYM 1009， 序列号：B436985256；可见分光光度计：品牌：菁华， 型号：JH-11-11 A-11-11-096， 厂家：上海菁华科技仪器有限公司， 仪器编号：A1111096；2.三孔电热恒温水槽：品牌：Blue pard， 型号

9、：DK-8D， 厂家：上海一恒科学仪器有限公司 上海一恒科技有限公司， 仪器编号：141022455；3.电泳仪：品牌：君意， 型号：JY600C， 厂家：北京君意东方电泳设备有限公司， 序列号：YD7F21310082；4.移液枪（0.510ul，10100uL，1001000ul），灭菌枪头，吸量管（1ml，5ml），洗耳球，试管若干，试管架，胶头滴管，烧杯，玻璃棒，试管刷，容量瓶（100ml，250ml，500ml），量筒，洗瓶，锥形瓶，圆口烧瓶（100ml，250ml，500ml，1000ml），药匙，离心管，柱层析管，橡胶管，铁架台，电热炉，签字笔，纸，标签等2.3实验试剂待测定酶液

10、（酶学研究室提供）邻硝基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG）溶液：1.2%水溶液，Na2CO3溶液：5%水溶液，ONP溶液，标准牛血清白蛋白标准溶液：配制成0.1mg/ml的溶液，考马斯亮蓝G-250，95%酒精，85%浓磷酸，蒸馏水，甘氨酸，浓盐酸，冰醋酸，醋酸钠，This，氢氧化钠，凝胶，洗脱液，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，10%SDS（W/V），10%过硫酸铵（W/V），甘油，0.1%溴酚蓝，重蒸水，2-巯基乙醇，TEMED等3.黑曲霉发酵生产3.1试验试剂1斜面培养基：PDA培养基 马铃薯40克，葡萄糖4克，琼脂34克，自来水200ml，自然pH 制法：马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂（煮沸2

11、030分钟，能用玻璃棒搓破即可），用四层纱布过滤，再加糖和琼脂加热融化后再补足水分1000ml，121下灭菌20分钟，备用。 2、液体发酵培养基：果胶2.5%，豆粕粉6%，玉米浆9%，（NH4）SO4 0.1% K2HPO4 1%，Tween-80 0.3%； 3、灭菌生理盐水：0.85gNaCl至100ml蒸馏水的三角瓶中，加上棉塞，外包一层牛皮纸，121下灭菌20分钟，备用。 4、黑曲霉菌株：产乳糖酶菌株黑曲霉DL116由河北农业大学食品院酶学研究室提供。5、灭菌枪头，备用。3.2试验方法 1、 菌种扩大培养：用接种环取乳糖酶菌株黑曲霉DL116接种与试管斜面培养基中，恒温箱培养箱中28下

12、保存，培养45天，备用。 2、 发酵培养：将菌种转接斜面活化，待孢子成熟后制备孢子悬液，接种发酵培养基进行摇瓶发酵，接种104个/ml。发酵条件为30，140r/min，装液量30ml/250ml。发酵培养7天备用。4.乳糖酶酶活力和蛋白质含量的测定4.1实验原理 <1>.乳糖酶活力测定方法：乳糖酶活力的测定方法：0.6%邻硝基苯酚-D-半乳糖苷(ONPG)溶液0.7 ml，55水浴预热5 min，加入适当稀释的待测酶液0.1 mL，继续保温10 min取出，加入0.8 mL 5% Na2CO3溶液显色，定容至8 mL，420 nm处比色。以加热灭活的待测液同样处理作为空白。用已知

13、浓度的ONP溶液做标准曲线，根据ONP的浓度C对应的OD值，利用最小二乘法建立回归方程：在上述条件下，每分钟水解ONPG产生1mol邻硝基苯酚(ONP)的酶量定义为1个酶活力单位(U)。<2>.Bradford检测法的原理：这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同的颜色形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液；当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。该化合物在465595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低呈正比关系。因此，可以通过检测595nm处的光吸收值的大小来计算蛋白质含量。4

14、.2试验试剂1、基苯酚-D-半乳糖苷（ONPG）溶液：1.2%水溶液。2、酸钠溶液：5%水溶液。 3、ONP溶液：1mg/ml 4、血清白蛋白标准溶液：0.1mg/ml5、染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%酒精50ml中，再加85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml，混匀备用。4.3试验方法4.1.1粗酶液制备4层纱布过滤发酵液，除去黑曲霉菌丝体。用PH=4.0的0.05mol/L的HAc/NaAc缓冲液洗涤菌丝体，洗涤液经4层纱布过滤后与过滤除菌的酶液合并。合并液经双层滤纸抽滤去除孢子即得粗酶液。 粗提液的制备;取摇瓶培养菌液，2000r/min离心10min，去

15、除沉淀，再经8000r/min离心30min，收集的上清液即为粗酶液。 <1>.标准曲线的绘制：管号012345标准蛋白质溶液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0染料溶液（ml）5.05.05.05.05.05.0蛋白质浓度（mg/ml）00.0030.0070.0100.0130.017A595nm00.1800.3240.3450.5580.556按表分别向各试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调0测定各管试管吸光值。以吸光值为纵坐标、蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 样品测定：取1ml样品溶液

16、（发酵液、可适当稀释），加入燃料溶液5ml，混匀，5min后在595nm波长处测定吸光值。对照标准曲线求得其蛋白质浓度。<2>.ONP标准曲线：ONP浓度mg/mL0.020.040.060.080.1吸光度0.2100.4240.7551.0431.218样品测定的吸光值：样品吸光值1.3011.3041.3051.3081.307ONP浓度mg/mL0.10430.10450.10460.10490.1048样品酶液量（ml）酶活力（U/ml）蛋白质含量（mg/ml）比活力（U/mg）总活力（U）发酵液0.160.210.01623716.676.021结果分析：5.PH值对乳

17、糖酶活性影响及最适PH值确定 5.1.系列缓冲溶液的配制 0.4mol/L pH2.03.0甘氨酸-盐酸系列缓冲液：X毫升1.6mol/L的甘氨酸+Y毫升1.6mol/L盐酸，再加水稀释至200毫升。(配比见下表)pHXYpHXY2.05044.03.05011.4 0.4 mol/L pH3.55.5的醋酸-醋酸钠系列缓冲液：pH0.4MNaAC0.4MHACpH0.4MNaAC0.4MHAC4.01.808.205.07.003.00 0.4 mol/L pH6.08.5的Tris-HCl缓冲液：4×0.605g This溶于水，浓Hcl调pH，定溶50ml。 0.4 mol/L

18、 pH9.010.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液：X毫升1.6mol/L的甘氨酸+Y毫升1.6mol/L氢氧化钠，再加水稀释至200毫升(配比见下表)pHXYpHXY9.0508.810.05032.0 5.2.试验方法将底物用相应不同的PH缓冲溶液配制（可用0.4mol/L的缓冲溶液与1.2%的ONPG水溶液等体积混合配制而成，替代实验2.2中0.6%邻硝基苯酚-D-半乳糖苷(ONPG)溶液，总体积0.7ml），在不同PH（如下表）、55下测定酶活性，测定方法相同。 pH2.03.04.05.06.07.08.09.0吸光值0.4271.6561.5391.4530.1160.0520.0510

19、.043酶活（U/ml） 20.59 76.0970.8166.936.543.653.603.24结果分析：<1>PH值对酶活性有较大影响，过低或过高的PH都可以抑制乳糖酶的活性<2>本实验条件下，乳糖酶的最适PH为36.温度对乳糖酶活性的影响及最适温度确定6.1实验方法酶反应最适温度及热稳定性：最适温度的测定在PH5、缓冲体系及不同温度（20-80）下进行酶促反应。测定方法同2.2中相同，改变反应温度，如下表：温度2030405060708090酶活（U/ml）温度2030405060708090吸光值0.3460.6211.0661.6201.7961.9740.

20、3120.159酶活（U/ml）16.9329.3549.4574.4782.4290.4615.398.486.2结果分析<1>温度对酶活性有较大影响，过低或过高的温度都可以抑制乳糖酶的活性<2>本实验条件下，乳糖酶的最适温度为707.蛋白质的层析、洗脱7.1.实验原理凝胶是具有一定孔径的网状结构物质，主要用于分离分子大小不同的生物大分子以及测定其相对分子量。相对分子质量小的物质可通过凝胶网孔进入凝胶颗粒的内部，洗脱时由于走的路线长，下来的慢，而相对质量大的物质不能进入凝胶颗粒内部，出来快。从而达到分离的目的。 由于蛋白质的相对分子质量较硫酸铵大得多，故可用凝胶层析方

21、法除去硫酸铵。7.2.试验方法样品制备：取5ml蛋白质溶液于离心管中，加3g硫酸铵粉末，边加边搅拌使之溶解，静置15分钟后，将其进行离心12000r/min，15分钟后，弃去上清液，加入适量tris-Hcl（1mol/l）缓冲溶液溶解沉淀物，即为样品。装柱：将层析柱垂直固定于铁架台上，将以处理好的葡聚糖凝胶G-25注入层析柱内，最好一次连续装柱，防止出现气泡和断层现象。平衡：将洗脱液与层析柱入口相连，用洗脱液平衡凝胶，液面保持高于凝胶床体。加样与洗脱：将柱中多余的液体放出，使液面刚好盖过凝胶，将样品小心沿柱内壁加入柱中，要小心不能触到凝胶表面。然后将层析柱上端封口，接上入口管，加入洗脱液，开始

22、洗脱。（加样量一般为床柱体积的1%10%，收集与测定：用部分收集器收集洗脱液，每3分钟移动一管。用G-250和醋酸铅检测，G-250遇到蛋白质变为青色，硫酸铵与醋酸铅反应有白色沉淀产生。结果分析：以蒸馏水+考马斯亮蓝作空白对照，以此测定吸光值调零。组数12345678910吸光值00.0360.5371.1251.1481.0000.7900.5890.5090.46011121314151617181920210.3800.3120.3030.2890.2400.1650.1720.0790.0410.1530.12222232425262728293031320.0920.0610.070

23、0.0660.0310.0570.0530.0510.0430.075-0.03利用凝胶柱层析法可将不同分子量的蛋白质洗脱分离开来，将测定的吸光值数据绘制成图表，在此曲线图中，一种波峰代表一种蛋白质，根据图表确定本实验中洗脱的蛋白质溶液中只含有一种蛋白质。7.3测定吸光值收集洗脱出的乳糖酶（样品）约30管，每管中取1ml样品加入4ml考马斯亮蓝，分别测定其吸光值A。 8.乳糖酶分子量测定-SDS-PAGE电泳法 8.1.凝胶配制如下表分离胶30%Acr5ml1M pH8.8This-Hcl缓冲液5.6mlH2O4.35ml10%SDS0.15ml10%过硫酸铵0.15mlTEMED20µL浓缩胶30%Acr0.835ml1M Ph6.8This-Hcl缓冲液0.625mlH2O3.52ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.07mlTEMED10µL8.2实验方法电泳槽安装密封灌胶加电极缓冲液点样电泳剥胶染色脱色成像8.3 结果分析本实验中根据SDS-PAGE电泳法测定乳糖酶分子量大约为135KD。9展望此次实验研究了黑曲霉产乳糖酶的发酵生产条件及其酶学性质研究，但是由于自身水平、实验时间及实验条件等因素的限制，本课题在研究过程中还存在一