细胞生物学实验步骤

1、冻存细胞的复苏1、于液氮罐中取出冻存管。2、37 C水浴锅中摇动，使之快速融化。3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加 2 倍培养液，混匀。4、离心：1500转/分， 3分钟，弃上清。5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中， 37C培养。组织块法培养骨骼肌细胞1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和 髋关节处剪取四肢（去爪） ，置培养皿中。2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。5、加少

2、量培养液，将组织剪成1mm3b块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶 底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入 37 C培养 箱静置 0.5-1 小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起） ， 37 C继续培养。贴壁细胞的传代和冻存1 、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。2、 加入PBS液 ,使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。4、加培养液终止消化。5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。6、将细胞悬液吸入离心管

3、中，离心 1500转/分， 3分钟，倒掉上清。7、加入 3ml 培养液于离心管中，吹打制悬。&取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心 1500转/分，3分钟。9、去上清，加入Iml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4 C 1小时-20 C 2小时 -80 C 2小时液氮的顺序进行冻存。细胞计数血球计数板每一大方格长为 Imm宽为Imm高为0.1mm体积为0.1mm, 可容纳的溶液是0.1 I ,那么每ml溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中 数出的细胞数的10000倍。实验步骤（一）准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干（二）制备细胞悬液：用胰蛋白酶消

4、化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于107ml ,若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm, 3min），重悬浮于少量培养液中。（三）加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。用吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样。（四）计数：在显微镜下，用 10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细 胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。计数堀慮-*9 *4IF«血球计数板示意图（五）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。细胞数/毫升

5、原液=（4大格细胞数之和/4 ）× 104×稀释倍数LiPOfeCtamine 2000 转染试剂转染步骤（24孔板）：1、转染前一天，胰酶消化细胞并计数，在24 孔板内放入玻片，细胞铺板，使其在转染日细胞密度为 70-85。细胞铺板在 1ml 含血清，不含抗生素的正常 生长的培养基中。2、配制溶液 A 和溶液 B（1）溶液A:对于每孔细胞，使用50ul无血清培养基稀释0.8UgDNA轻轻 混匀。（2）溶液B:使用前将LiPOfeCtamine 2000 转染试剂轻轻混匀，用 50ul无 血清培养基稀释 2ul Lipofectamine 2000 转染试剂，轻轻混匀。3、

6、室温下孵育 5min。4、将溶液A逐滴加入溶液B中，轻轻混匀。室温放置20分钟。5、将 24孔板中的旧培养液吸出，用无血清培养基清洗两次。6、 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在4-6 小时后观察 细胞，更换培养基。 （ steP1-steP6: 转染 1 ）7、在37C, 5% C（O中继续培养。8、48h 后，用荧光显微镜观察。细胞凋亡检测1、 取洁净盖玻片于多聚赖氨酸中浸泡 5mi n,紫外消毒，无菌超净台内吹干。 将盖玻片置于培养皿中，接种细胞培养，使为50%-80%满。2、加入HQ （200 mol/l ）刺激细胞发生凋亡，2h后换液，继续培养过夜。（step1 st

7、ep2:凋亡 1） （HkQ 储存浓度为：0.01 mol/ l）3、取出细胞爬片（注意细胞面朝上） ，放入玻璃培养皿中，吸尽培养液，用 丙酮溶液室温下固定细胞 10 min。4、去固定液，用PBS洗涤2遍，每次3min ,吸尽液体。洗涤时宜用摇床或 手动晃动数次。5、加入0.5ml HOeChSt 33342 染色液，染色5min,也用摇床轻轻晃动，注 意避光。6、用PBS洗两遍，每次3分钟。7、滴 10ul 封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免空气，使 细胞接触封片液（细胞面朝下） ，切勿弄反。&设空白对照：与试验平行不加 HQ ,只加培养液的空白对照细胞增殖的检测（M

8、TT法）1、 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul, 铺板（ 96 孔平底 板）使待测细胞调密度至 5000-8000孔，5%CO37C培养过夜。2、 第二天加入浓度梯度的 HO （0、50、100、200、400、800 mol/l ）。药 物浓度 6个梯度,设 3个复孔。3、5%CQ 37C孵育2小时，倒置显微镜下观察，换液，每孔 100ul培养液，继续培养过夜。（step1 step2: MTT 1 ）4、每孔加入20ul MTT溶液（5mgml,即卩0.5%MT） 继续培养4h。5、终止培养，小心去除孔内培养液。6、每孔再加入 150ul 二甲亚砜，在酶联免疫检测仪中振荡混匀， 使结晶物充 分溶解，OD490nm处测量各孔的吸光值。免疫荧光1 、细胞培养在盖玻片上，长到 60-80%时取出（注意细胞面朝上）放到玻璃培养皿中。2、PBS洗细胞3次，每次3min。? 3、丙酮溶液室温下固定细胞10 min，PBS洗两次，用滤纸吸干多余液体。?4、 10%羊血清温育 10min。? 5、弃封闭液，直接滴加约15L （1: 50稀释）抗微管蛋白抗体（一抗）在生长有细胞的盖玻片上，放入湿盒内，4C孵育过夜。（step1 step6: MTT1 ）? 6、PBS洗涤3次，每次洗3min。用滤纸吸去水分，略干燥。? 7、在盖玻片上