梅毒螺旋体检测标准操作规程

1、文件名称梅蠹螺旋体检测标准操作规程编码贞数实施日期制订人审核人批准人制订日期审核日期批准日期目 的：规范的梅蠹螺旋体检验操作，确保检测结果准确。适用范围：性病实验室工作人员责任人：实验操作者1、标本的采集与处理1.1标本采集的基本要求1.1.1操作应规范化。1.1.2所有标本都应当被视为具有传染性，医务人员应戴手套谨慎操作。1.2梅蠹标本采集梅蠹的实验室诊断主要有病原体检测和血活学检测方法,各期梅蠹的检测方法 及部位见下表。临床表现取材部位检查方法一期梅蠹波疡、淋巴结、血液暗视野检查、血活学检查二期梅蠹皮损、淋巴结、血液暗视野检查、血活学检查潜伏梅蠹血液血活学检查二期梅蠹血液、脑脊液血活学检查

2、神经梅蠹血液、脑脊液血活学检查1.2.1血液1.2.1.1 血活标本根据需要，用一次性真空采血针与促凝采血管抽取静脉血2-5 ml ,室温静置1-2小时（或37C静置30分钟），待血液凝固、血块收缩后，3000r/min离心10- 15分钟，分离新鲜血活，备用。也可采用保存于2-8 C或-20 C的血活。溶血、脂血或污染的标本可影响试验结果。1.2.1.2血浆标本根据需要，用一次性真空采血针与抗凝采血管抽取静脉血2-5 ml ,轻轻颠倒混匀8-10次，3000r/min离心10-15分钟，分离血浆，备用。血库血浆以及 EDTA抗凝血浆同样可以用于梅蠹血活学实验（一般仅用于RPR实验，），但易出

3、现假阳性反应（需用血活复试），如用其他抗凝剂应首先评价后再用。1.2.1.3末梢全血消蠹局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择手指或耳垂，1岁以下儿童采用足 跟部）0 一次性采血针刺破皮肤，用无菌棉签擦掉第一滴血。收集滴出的血液， 立即用于检测。1.2.2皮损部位组织液1.2.2.1用于病原学检查用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片立即用于暗 视野显微镜检测，或取渗出液直接涂片，用于镀银染色试验。1.2.2.2用于核酸检测用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀/刮勺轻刮、挤压皮损部位，刮取渗出液

4、，加入有 DNA呆存液（1ml/管）的标本管中，备用。1.2.3淋巴液无菌操作下穿刺腹股沟淋巴结，注入 0.3ml无菌生理盐水并反复抽吸2-3次， 取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片后立即进行暗视野镜检或备用。1.2.4脑脊液操作由专业人员进行，一般用腰椎穿刺术获得。患者侧卧于硬板床，两手抱膝 紧贴腹部，头向前胸屈曲，使躯十呈弓形，以骼后上棘连线与后正中线的交点 为穿刺点，相当于第3-4腰椎棘突间隙，消蠹处理后，用 2呀1多卡因自皮肤到 椎问韧带作局部麻醉。术者用左手固定穿刺皮肤，右手持穿刺针以垂直背部方向缓缓刺入，针尖稍斜向头部，成人进针深度约4-6cm,儿童约2-4cm。当针头穿过韧

5、带与硬脑膜时，有阻力突然消失落空感，此时可将针芯慢慢抽出，即可见脑脊液流出，至于合适的容器中，备用。1.3标本接收的标准1.3.1核对样品与运送单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将 尚存留的样品移出，对样品管和盛器消蠹并做记录。1.3.2检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、脂血以及黄疸等情 况。如果样品污染或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弁。并将样品情 况立即通知运送机构。1.3.3对不合要求的标本，可以拒绝接受。2、梅蠹的实验室检查2.1梅蠹螺旋体暗视野显微镜检查2.1.1原理梅蠹螺旋体侵入人体后，在皮肤黏膜下增殖，并很快沿着淋巴管到达附近淋巴 结，经过2-4周的

6、潜伏期，在侵入部位发生炎症反应，称为硬下疳，数天到 1 周后，淋巴结肿大。二期梅蠹是梅蠹螺旋体由局部经淋巴结进入血液，在人体 内大量播散后而出现的全身表现，一般发生在感染后的7-10周或硬下疳出现后6-24周，主要为皮肤黏膜损害，有扁平疣、黏膜斑和玫瑰斑疹等。患梅蠹的孕 妇可以通过胎盘使胎儿受染。研究证明，在妊娠期7周时，梅蠹螺旋体即可通过胎盘。其梅蠹患者硬下疳、淋巴结、皮肤黏膜损害以及孕妇羊水中均可检查 到梅蠹螺旋体。将标本置于暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片 上，可使梅蠹螺旋体折射出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检 测。2.1.2方法2.1.2.1仪器耗材：1）暗视野

7、显微镜2）无菌纱布3）不锈钢刮刀4）灭菌棉拭子5）载玻片、盖玻片6）注射器，注射针头7）灭菌生理盐水2.1.2.2检测流程1）将待检标本制成生理盐水涂片，加盖玻片后立即备检。2）在预先调整好的暗视野显微镜的聚光器上加数滴浸油，轻轻调低聚光器， 使之在载物台下方。3）将标本玻片置载物台上，上升聚光器，使浸油接触载玻片底面，避免浸油 内有气泡。4）镜检：先低倍后高倍，寻找有特征形态和运动方式的梅蠹螺旋体。2.1.3结果2.3.1.1结果判读：在暗视野显微镜下观察，发现有纤细、白色、有折光的螺旋状微生物，长 6- 20um,直径小于0.2um，有6-14个螺旋，具有旋转、蛇行及伸缩等特征性的运 动方

8、式，可判断为梅蠹螺旋体。2.3.1.2结果报告：暗视野显微镜下若发现上述特征的梅蠹螺旋体则报告阳性结果；未见到上述特 征的梅蠹螺旋体则报告阴性结果。2.1.4临床意义1）梅蠹螺旋体暗视野显微镜检测阳性在临床上可确诊梅蠹，特别是对于有皮 肤黏膜损害和淋巴结病变的一、二期梅蠹的诊断具有重要价值，且具有快 速，方便，易操作等特点。2）若未能发现梅蠹螺旋体，不能排除梅蠹诊断。阴性结果原因可能为：标本中的微生物数量不足（单次的暗视野检测其敏感性低于50%、病人已接受治疗、皮损已接近自然消退或取自非梅蠹性皮损。3）无论暗视野显微镜检查的结果如何，都应进一步进行血活学检测。2.1.5注意事项1）取材前，应用

9、无菌生理盐水活洁皮肤表面，取材时应注意无菌操作。2）应取到组织渗出液，尽量避免出血，以提高检出阳性率。3）取材后应立即置暗视野显微镜下观察，如搁置太久，梅蠹螺旋体活动能力 会下降，导致镜下难以观察到阳性结果。4）对口腔溃疡标本，在暗视野显微镜下如观察到梅蠹螺旋体的特征性形态和 运动方式，应与其他螺旋体相区别。2.2.甲苯胺红不加热血活试验（TRUST2.2.1原理梅蠹螺旋体一旦感染人体，宿主迅速对感染早期被损害的自身细胞以及梅蠹螺旋体细胞表面所释放脂类物质做出免疫应答，在 3-4周内可产生抗类脂抗原的 抗体（亦称为反应素）。这种抗体在体外可与心磷脂、卵磷脂和胆固醇等组成的 抗原（0.03%b磷

10、脂、0.21%磷脂和0.90%胆固醇）发生抗原-抗体反应。心磷 脂、卵磷脂和胆固醇都是醇溶性脂类，遇水形成胶体溶液。当含有反应素的梅 蠹血活与之混合时，即粘附在胶体颗粒的周围。经摇动、碰撞，形成抗原抗体 复合物，出现凝集颗粒，即为阳性反应。甲苯胺红不加热血活试验即在抗原中 加入甲苯胺红颗粒作为指示物，与待检血活（浆）中的反应素结合，形成肉眼 可见的红色絮状物。血活不需灭活，肉眼可观察结果。2.2.2方法2.2.2.1仪器耗材：1）TRUSTS 剂盒2）水平旋转仪：要求旋转环状直径为2cm,转速为（100± 2） r/min ,并带有计时器和保湿盖）3）无菌生理盐水（0.9%）2.2.

11、2.2检测流程：2.2.2.2.1 定性试验1）试剂准备：检测前将试剂盒置室温预温 30分钟2）加标本：吸取50 l血活（浆）置试验卡片圈中，并均匀地涂布在整个卡 圈内。不能将标本溢出环圈外面。3）加抗原：将抗原轻轻摇匀，在每个标本圈中，用专用滴管针头垂直滴加1滴（60土 1滴/ml ,约17l/滴）抗原，不需要手工混匀。4）反应：将卡片置水平旋转仪上，建议罩上保湿盖，（100土 2） r/min旋转8分钟5）从旋转仪中取出卡片后立即在亮光下用肉眼观察结果。用手轻微的旋转或 倾斜卡片可有助于弱阳性和阴性标本。2.2.2.2.2 定量实验1）实验卡片准备：在卡片中圈1到圈4中分别标上1:2 ,

12、1: 4, 1: 8, 1: 162）稀释液准备：在圈1到圈4中加入50 l生理盐水，勿将盐水液滴涂开。3）标本稀释：吸取50 l血活（浆）于圈1中，用移液器来回吸放 5-6次已混合圈1中的生理盐水和标本，但要避免产生气泡。从圈 1 （1:2）中移取 50 l到圈2（1: 4）用上述同样方法混合后依次稀释至圈3（1: 8）和圈4（1: 16）。混旋后从圈4中弃去50 1。4）依次从圈4-圈1将不同稀释度的标本涂布整个圈内。5）加抗原等以下实验步骤同定性试验的 2-4。6）如阳性反应滴度大于1；16,则继续稀释以测定最高稀释反应滴度。2.2.3结果2.2.3.1 结果判读1）阳性反应：圆圈内出现

13、中或大的红色絮状物，液体活亮；2）弱阳性反应：圆圈内出现小的红色絮状物，液体混浊；3）阴性反应：圆圈内仅见炭颗粒集中于中央一点或均匀分散。2.3.3.2结果报告1）定性试验：出现凝集反应报告阳性，不产生凝集反应报告阴性。2）定量实验：出现凝集反应的血活最高稀释倍数为抗体滴度，结果报告滴度 为1: X, X依次为1、2、4等稀释倍数。2.2.4临床意义1）梅蠹螺旋体一旦感染人体后产生抗类脂抗原的抗体，未经治疗可长期存 在。经适当治疗后，抗体可以逐渐减少至转为阴性，早期梅蠹（一期、二 期）经足量规则抗梅蠹治疗后 3个月，TRUSM体滴度可下降2个稀释度， 6个月可下降4个稀释度，一期梅蠹一般约1年

14、后可转为阴性，二期梅蠹 2 年后可转为阴性。但晚期梅蠹治疗后血活滴度下降缓慢，2年后约50咐人血活反应仍为阳性。2）TRUSTS性试验结果可用于现症梅蠹诊断。TURSTm量试验结果可用于疗效 观察和判愈。2.2.5注意事项1）生物学假阳性：非梅蠹螺旋体抗原血活学试验采用的抗原为心磷脂、卵磷 脂和胆固醇的混合物，所检测的抗心磷脂抗体易见于其他多种疾病，如急 性病蠹性感染、自身免疫性疾病、结缔组织病、静脉吸蠹者以及怀孕的妇 女等。因此该类反应会出现假阳性反应。所以该类试验阳性标本需进一步 采用梅蠹螺旋体抗原血活学试验（如 TPPA ELISA）等复检，以排除生物学 假阳性，确认是否为梅蠹螺旋体感染

15、。2）前带现象：只对早期梅蠹患者进行非梅蠹螺旋体抗原血活试验时，有时血 活中存在高浓度的抗体，导致抗原抗体浓度不匹配，出现弱阳性、不典型 或阴性反应的结果，此时需将血活稀释后再进行试验，可出现阳性结果。该现象称为前带现象。2.3梅蠹螺旋体明胶凝集试验（TPPA2.3.1原理梅蠹螺旋体颗粒凝集试验（TPPA是用超声裂解梅蠹螺旋体抗原致敏明胶粒 子，致敏粒子与待检血活（浆）中的梅蠹螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的颗 粒凝集。2.3.2方法2.3.2.1仪器耗材：1）TPPA佥测试剂盒2）移液器3）保湿盒2.3.2.2检测流程：1）试剂准备：试验前30分钟将待检标本和试剂从冰箱中取出，恢复至室温。2）

16、加稀释液：每份样本作 4孑L,用移液器将血活稀释液滴入微量反应板第1孑L （10011 ）,从第2孔-第4孔各滴25 l。3）样本稀释：用移液器取待检血活 25 1置第1孔中，然后以2n的方式从第 1孔稀释至第4孔。4）加对照液：用移液器在第3孔滴入25 l未致敏粒子；在第4孔滴入25 l致敏粒子。5）混合：以不会导致微量反应板内容物溅出的强度混合30秒钟。6）反应：加盖置湿盒内，于室温（15C -30 C）下水平静置。2小时后观察并 记录结果。附：重吸收试验对于未致敏粒子和致敏粒子均显示土以上凝集的样品，要按照下列程序在完成 吸收操作的基础上进行再试验。1）取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子

17、 0.95ml至小试管中。2）加入样品50 l混合，于室温（15C-30C）下放置20分钟以上。3）离心分离（2000rpn 5分钟），然后分别吸取上活液【吸收完毕的稀释样品（1: 20）】50 l至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。4）从第4孔以后，要预先各滴入25 l血活稀释液，从第3孔至最后一孔用 移液器以2n的方式进行稀释。5）之后的步骤同上。2.3.3结果2.3.3.1结果判读首先观察未致敏粒子反应孔是否出现凝集（第 3孔），判断试验有效性后，再根 据致敏粒子与标本反应孔（第 4孑L）与致敏粒子是否产生 1+2+S集反应凝 集反应，判断结果。如未致敏粒子反应孔出现凝集（第 3孑L

18、）为无效试验，需 要对标本进行重吸收试验后再进行检测。+ :产生均一的凝集，凝集粒子在底部，呈膜状延展；+ :粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱的凝集在周围；土 ：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形；-:粒子呈纽扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。2.3.3.2结果报告阳性：未致敏粒子反应孔（第 3孑L）不出现凝集，致敏粒子反应孔（第 4孑L） 出现1+2+凝集反应，报告阳性。阴性：未致敏粒子反应孔（第 3孑L）和致敏粒子反应孔（第 4孑L）均未出现凝集反应，报告阴性。弱阳性：未致敏粒子反应孔（第3孑L）不出现凝集，致敏粒子反应孔（第孔）出现土凝集反应，报告弱阳性。2.3

19、.4临床意义1）梅蠹螺旋体一旦感染人体后约 2-4周即可检测到抗梅蠹螺旋体抗体，此抗 体特异性高可达98恕上，所以检测到梅蠹螺旋体抗体阳性可确证为现在或 既往有过梅蠹螺旋体感染。2）患者感染梅蠹螺旋体后产生的抗梅蠹螺旋体抗体一般能保持终生，梅蠹患 者即使经过正规疗程的抗梅蠹治疗后，梅蠹螺旋体抗原血活学试验仍可阳 性，故梅蠹螺旋体抗原血活学试验不能作为疗效观察的指标。3）梅蠹螺旋体抗原血活试验亦不能区分既往感染和现症感染，试验阳性结果 应进一步进行非梅蠹螺旋体抗原血活试验，以判断是否为梅蠹现症感染。2.3.5注意事项1）若未致敏粒子孔出现凝集反应，血标本需要进行吸收后再重复试验，或改 用其他方法

20、复检。2）试验加入致敏粒子、未致敏粒子后，应以不会导致微量反应板内容物溅出 的强度混合。3）红细胞及其他血液的有形成分会影响结果，所以血液标本应通过离心分离 血活。4）致敏粒子以及未致敏粒子在使用之前均应混合均匀后再使用。5）微量反应板中的内容物充分混匀后再静置，静置过程中一定要对反应板加 盖并禁止振摇。6）梅蠹螺旋体感染初期，有可能不产生抗体，或虽然产生抗体但数量很少的 情况。2.4梅蠹螺旋体IgM检测2.4.1原理梅蠹螺旋体溶解物经处理后，将其中的螺旋体蛋白成分用聚丙烯凝胶蛋白电泳 按分子量分僻，之后经二次电泳转移至硝化纤维薄膜上，风十切片，最后制成 测试条，病人血活稀释后与检测条一起孵育

21、，如果存在梅蠹螺旋体特异性抗 体，则抗体会与相应的抗原条带结合。冲洗未结合的酶结合抗体后，测试条最 后与染色剂反应，在与抗原条带结合的抗体上产生紫色的沉淀。在特异性条带（15.5 , 17, 47KD上产生的反应具有临床意义。在其它位置也有可能出现条 带，但并不具有临床意义。每条测试条的顶端数字标签下都有血活和酶的加样 质控带。这些质控带用于确认病人样本和酶的加样。2.4.2方法2.4.2.1仪器耗材1）梅蠹螺旋体IgM试剂盒2）移液器3）平台摇摆仪2.4.2.2检测流程1）用钝头镶子按需将电泳条取出（手不能碰到电泳条），放在孵育盒的小槽中，每槽一条，数字面向上。2）注意检测条使用前需预湿处理

22、，直接对着检测条中央缓慢加入2.0ml样本稀释液/冲洗液至每一槽中，确保所有检测条浸湿，检测条不能部分漂于缓 冲液面上。3）将孵育盒置于平台摇摆仪上（设置最小摆角7° ± 20 ,40-45个循环/分钟），浸泡及摇摆至少5分钟。4）在第一第二槽分别加入80ul阳性质控及阴性质控，在各相应槽中加入 20ul 病人血活标本，当缓冲液流至槽的前端时加入。5）将孵育盒置于平台摇摆仪，孵育及摇摆45分钟，之后取出。小心倾斜孵育盒倒出液体。6）在每槽中加入2.0ml样本稀释液/冲洗液，置于平台摇摆仪摇摆 5分钟7）完全倒出小槽中液体，重复6, 7步骤2次8）在每槽中加入2.0ml稀释后的酶结合抗人IgM抗体，防止平台摇摆仪赋予 及摇摆15分钟。9）倾斜孵育盒倒出酶结合抗人IgM抗体10）在每槽中加入2.0样本稀释液/冲洗