微生物学法检测面包虾的相关致病菌

1、福建农林大学本科毕业论文 论文题目：微生物学法检测面包虾的相关致病菌 学 院： 专业年级： 学 号： 姓名： 指导教师、职称： 年 月 日 Pathogens detection of bread shrimp by microbiological methodSubmitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in School of Life Sciences, FAFU College: School of Life Sciences Speciality: Biology Ent

2、rance year: I.D. No.: Candidate: Supervisor: （lecturer） Submitted: 目 录摘要11 引言21.1 面包虾致病菌检测的重要性21.2 面包虾致病菌检测的作用31.3 面包虾检测的项目与方法32 材料与方法42.1面包虾沙门氏菌的检测42.1.1 材料42.1.2 方法52.1.3 步骤52.2 面包虾单核细胞增生李斯特氏菌检测52.2.1 材料52.2.2 方法62.2.3 步骤62.3面包虾的金黄色葡萄球菌的检测62.3.1 材料62.3.2 方法72.3.3 步骤72.4面包虾的副溶血性弧菌的检测72.4.1 材料72.4.2

3、 方法82.4.3 步骤83 结果与分析83.1 沙门氏菌的检测结果83.1.1 检测结果83.1.2 结果分析93.2 单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果93.2.1 检测结果93.2.2 结果与分析103.3 金黄色葡萄球菌的检测结果103.3.1 检测结果103.3.2 结果分析123.4 副溶血性弧菌的检测结果123.4.1 检测结果123.4.2 结果与分析134 结论145 实习心得体会14参考文献16致 谢18微生物学法检测面包虾的相关致病菌 吴晓慧摘要：随着社会的发展，人们生活水平的提高，水产品也从自然生长发展到人工养殖。在人们的日常膳食中所占比例也不断提高，其质量安全也显得越发

4、重要。通过对产品的微生物检测，是保证食品的质量与安全的措施之一。本文着重介绍了面包虾的不同致病微生物检测的方法。对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌的检测进行实验，得出结果，对结果进行讨论与分析。并把实验所运用的检测方法与国内外的其他方法相比较，对企业提出建议。关键词：面包虾 微生物检测 沙门氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 金黄色葡萄球菌 副溶血性弧菌 1 引言1.1 面包虾致病菌检测的重要性食品安全关系到广大人民群众的身体健康和生命安全，关系到经济健康发展和社会稳定，关系到政府和国家的形象。食品安全已成为衡量人民生活质量、社会管理水平和国家法制建设的一个重要方面。随

5、着生活水平的提高，人们对食品的安全要求越来越高，而一些食品的安全问题也越来越引起人们的关注，成为现阶段我国亟待解决的问题1。根据问题的重要性来排列，目前我国存在的主要食品安全问题依次为：微生物引起的食源性疾病、农药残留、兽药残留、重金属、天然毒素、有机污染等引起的化学性污染；以及非法使用食品添加剂。而大部分食源性疾病是由致病微生物引起的。沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌都是常见的致病微生物2。 沙门氏菌(Salmonella)可以引起：肠热型(伤寒、副伤寒)，开始出现发热不适、全身疼痛，此后患者出现持续高热、相对脉缓、肝脾肿大，外周白细胞下降、皮肤出现玫瑰疹。严重

6、肠局部坏死和溃疡，有出血、穿孔等并发症。急性胃肠炎型(食物中毒)，潜伏期1224小时，突然恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热，如果细菌已产生毒素，可引起中枢神经系统症状，出现体温升高、痉挛等；重者有寒战，惊厥，抽搐与昏迷，病程37天，预后良好。类霍乱型，类伤寒型，类感冒型，败血症型3。单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)4是一种人畜共患食源性致病菌，可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、早产等疾病，危害较大。对孕妇、婴儿、老年人级免疫力低下者更容易发生。金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪

7、膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus），进食含有该菌的食物可致食物中毒，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。 FAO/WHO于2002年公布了沙门菌病在一些主要国家的年发生率，即每10万人中每年发生的病人数：澳大利亚为38、德国为120、日本为73、荷兰为16、美国为145。沙门菌的危害程度可见一斑。因此，对以上各类病原微生物的检测非常重要。而微生物学检验，是用细菌学的方法来检查水产品的质量、水产品加工过程的卫生措施情况和水产品保藏方法是否有效5，这对保证食品安全来说是至关重要的一个环节。1.2 面包虾致

8、病菌检测的作用 在面包虾的安全检测上，目前对面包虾的微生物检测作用主要是6：严格控制原辅料的质量，保证食品的质量与安全；掌握生产过程情况和产品决定工艺条件的依据；控制产品质量，把好出口关；进行经济核算的依据；进行科学研究工作的手段。以此来保证半成品和种产品的卫生符合产品标准，保证消费者的权益。保证食品的卫生质量即安全，避免食物中毒的发生。 另外，通过微生物的检测结果，我们可以监测生产过程中是否存在严重偏差（如半成品受到污染），以便及时纠正和召回产品；二是积累数据并定期分析，并根据分析结果来监测生产过程、工艺、产品质量等是否出现波动、偏差和漂移，以便纠正和调整（回顾性验证）5。如大肠菌群被检出，

9、表明食品被粪便直接或间接污染，食品就有可能污染了致病菌。金黄色葡萄球菌被检出表明食物被人或动物接触过。就目前状况看，除肉类食品在屠宰中被粪便污染造成沙门氏菌污染、蛋从粪便污染、奶源由于乳房炎污染外，大都与人手接触有关。人手上有时就有大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌。副溶血性弧菌是由海产品污染的。如果微生物学检验中出现不合格的情况时，就要查看相关的生产环节。因此对生产也是有指导意义的。1.3面包虾检测的项目与方法 在面包虾的生产中，其检测项目包括7：微生物检测中一般污染（菌落总数，大肠杆菌）和致病菌（单核细胞增生李斯特氏菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌等），常规微生物检验以分离培

10、养、生化试验、血清学试验来进行判定。也有理化检测项目为氯霉素、呋喃唑酮、磺胺类、孔雀石绿、砷、汞8等，依据产品出口的不同国家有不同标准。近年来，由于养殖环境污染，养殖鱼虾贝类受到污染已成为世界许多地方的问题。常规的培养法无法检测到处于这种状态的细菌，造成漏检，从而形成危害，因此寻找一种准确快速的检测方法非常重要。病原微生物快速检测方法包括分子生物学技术、免疫学技术、代谢技术、纸片法、细菌直接计数法、噬菌体鉴定技术、全自动微生物分析系统等。和传统方法比较，更快、更方便、更灵敏。 其中，ELISA（酶联免疫吸附试验）9检测微生物的优点受到人们越来越多的关注。主要用于检测水产品中微生物、水产动物致病

11、微生物检测等，ELISA在水产微生物检测中的应用在国内刚起步。预测微生物技术在湿润的蛋白质食品（鱼虾、乳制品、红肉和家禽）中应用比较广泛10。这是借助计算机微生物数据库，在确定相关温度、pH、水分活度、防腐剂等环境因素下，应用预测微生物的数字模型，快速对重要微生物的生长、存活和死亡进行预测，应用栅栏技术，确保水产品生产、运输、储存等过程中的安全和稳定。因此，在常规的微生物学检验为基础，结合酶联免疫法或预测微生物技术等其他先进技术进行产品的综合检测，是未来进行面包虾病原微生物检测的主流方向。目前国内大多在采用微生物学检测方法。2 材料与方法2.1面包虾沙门氏菌的检测2.1.1 材料 （1）样品

12、待检测的面包虾。（2）试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、沙门氏菌属显色培养基。（所用试剂均用北京陆桥公司的产品，按其使用方法进行配制）。（3）仪器和设备 冰箱（2-5 ）、恒温培养箱（36 ±1 、42 ±1 ）、无菌杯、电子天平（感应量0.0001 g）、灭菌锥形瓶（500 ml、250 ml）、灭菌移液管（1ml、10 ml）、灭菌培养皿（直径90 mm）、灭菌试管、灭菌手术剪和镊子。2.1.2 方法 通过培养基中的微生物培养，观察有无沙门氏菌的存在。2.1.3 步骤（1） 前增菌11：面包

13、虾在2 -5 解冻，不超过18 h。无菌操作，称取25 g样品，用手术剪剪碎，放入盛有225 mlBPW的无菌杯中，混匀。无菌操作将样品转至500 ml锥形瓶中，于36 ±1 培养8 h-18 h。（2） 増菌：轻轻摇动培养过的样品混合物，移液管移取1 ml，转种于10 mlTTB内，在42 ±1 培养18 h-24 h。同时，另移取1 ml，转种于SC内，在36 ±1 培养18 h-24 h。（3） 分离：分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个沙门氏菌属显色培养基平板。于36 ±1 培养18 h-24 h（沙门氏菌属显色培养基平板）

14、或40 h-48 h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。（4） 鉴定：自BS琼脂平板上挑取黑色有金属光泽、棕色至绿色和沙门氏菌属显色培养基上挑取圆形、光滑突起的（浅）红紫色的可疑菌落，进行生化鉴定。2.2 面包虾单核细胞增生李斯特氏菌检测2.2.1 材料（1） 样品 待检测的面包虾。（2） 试剂 李氏增菌肉汤 LB（LB1 ，LB2）、李斯特氏菌显色培养基、生化鉴定试剂盒。（所用试剂均用北京陆桥公司的产品，按其使用方法进行配制）（3） 仪器和设备 冰箱（2-5 ）、恒温培养箱（30 ±1 、36 ±1 ）、无菌杯、电子天平（感应量0.0001 g）、无菌锥形瓶（50

15、0 ml、250 ml）、无菌培养皿（直径90 mm）、无菌试管、无菌手术剪和镊子。2.2.2 方法 通过培养基中的微生物培养，观察有无单核细胞增生李斯特氏菌的存在。2.2.3步骤 （1） 増菌12：面包虾在2 -5 解冻，不超过18 h。无菌操作，称取25 g样品，用手术剪剪碎，加入到含有225 ml LB1前增菌液的无菌杯中，混匀。于30 ±1 培养24 h ，移取0.1 ml ，转种于 10 ml LB2增菌液内，于30 ±1 培养18 h-24 h 。（2） 分离：取LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色培养基上，于36 ±1 培养24 h-48 h ，

16、观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征为紫红色。（3） 鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 MR-VP 试验（生化试剂盒）。2.3面包虾的金黄色葡萄球菌的检测2.3.1 材料 （1） 样品 待检测的面包虾。（2） 试剂 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤（BHI）、血浆凝固酶培养基（商品试剂盒）。（所用试剂均用北京陆桥公司的产品，按其使用方法进行配制）（3） 仪器和设备 冰箱（2-5 ）、恒温培养箱（36±1、42±1）、均质器、电子天平（感应

17、量0.0001 g）、无菌锥形瓶（500 ml、250 ml）、无菌吸管（10 ml）、无菌培养皿（直径90 mm）、无菌试管、无菌手术剪和镊子。2.3.2 方法 通过培养基中的微生物培养，观察有无金黄色葡萄球菌的存在。2.3.3 步骤（1） 增菌13：面包虾在2-5解冻，不超过18h。无菌操作，称取25g样品，用手术剪剪碎，放入盛有225 ml 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌杯中，混匀，于36 ±1 培养18 h-24 h。（2） 分离：将上述培养物，接种到Baird-Parker平板，36 ±1 培养18 h-24 h。（3） 鉴定：金黄色葡萄球菌在Baird-Par

18、ker平板上，菌落直径2 mm-3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为浑浊带，在其外层有一圈透明圈。挑取可疑菌落进行血浆凝固酶试验。（4） 血浆凝固酶试验：挑取可疑菌落1个或以上，接种到5 ml BHI试管中，36 ±1 培养18 h-24 h。接种到血浆凝固酶培养基上，观察结果。2.4面包虾的副溶血性弧菌的检测2.4.1 材料 （1）样品 待检测的面包虾。（2）试剂 3 %氯化钠碱性蛋白胨水、3 %氯化钠三糖铁（TSI）、弧菌显色平板。（所用试剂均用北京陆桥公司的产品，按其使用方法进行配制）。（3）仪器和设备 冰箱（2-5）、恒温培养箱（36 ±1 ）、均质器、电

19、子天平（感应量0.0001 g）、无菌锥形瓶（500 ml、250 ml）、无菌吸管（1 ml、10 ml）、无菌培养皿（直径90 mm）、无菌试管、无菌手术剪和镊子。2.4.2 方法 通过培养基中的微生物培养，观察有无副溶血性弧菌的存在。2.4.3 步骤（1） 增菌14：面包虾在2 -5 解冻，不超过18 h。无菌操作，称取25 g样品，用手术剪剪碎，放入盛有225 ml 3%氯化钠碱性蛋白胨水的无菌杯中，混匀，制备成1:10的均匀稀释液。于36 ±1 培养8 h-18 h。（2） 分离：在上述增菌液中用接种环沾取一环，于弧菌显色平板上划线分离，于36 ±1 培养18 h

20、-24 h。（3） 鉴定：典型的副溶血性弧菌在弧菌显色平板上呈品红色菌落。（4） 初步生化试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3 %氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 ±1 培养24 h，观察结果。如还是可疑，再进行生化鉴定。3 结果与分析3.1 沙门氏菌的检测结果 3.1.1 检测结果 图1 所示为BS平板，图2所示为沙门氏菌显色平板，如下： 图1 BS平板 图2 沙门氏菌显色平板 结论：综合菌落形态，报告每25 g样品中未检出沙门氏菌，所检样品为合格的产品。3.1.2 结果分析 （1） BS琼脂平板上看出并无有金属光泽的疑似菌落，沙门氏菌属显培色养基上也无红紫色的可疑菌落。因此

21、没有进行接下来的生化检测，就可以确定样品中不含沙门氏菌。（2） 由于面包虾样品中沙门氏菌数量较少，对其分离，一次直接作选择培养,常不易成功。特别对生长速率缓慢的沙门氏菌,如鸡白痢沙门氏菌和鸡沙门氏菌更是如此,因而常常先作增菌培养。在此操作过程中前增菌时间要相应长点，一般为十小时。确保因加工而受伤濒死的沙门氏菌恢复活力。（3） 亚硫酸铋（BS）琼脂不可加热过度，使用前一天配制，且48小时内使用，倾注平板前需摇匀，平板需要避光存于室温环境15。3.2 单核细胞增生李斯特氏菌的检测结果 3.2.1 检测结果 从显色平板中可看见紫红色疑似单核细胞增生李斯特氏菌的菌落，见图3。进一步进行了生化鉴定，单核

22、细胞增生李斯特氏菌的过氧化氢酶试验为图4所示。 图3 单核细胞增生李斯特氏菌显色平板 图4 过氧化氢酶试验结论：综合菌落形态和生化特征，报告每25 g样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌，所试样品为合格的产品。3.2.2 结果与分析（1） 由过氧化氢酶试验图片看出，该管不产气泡，结果为阴性 16。因此，不需要再做糖发酵试验和 MR-VP 试验。（2） 由于单增李斯特氏菌在4 下仍然能生长繁殖17，当样品取来后，样品在冰箱中易滋生单增李斯特氏菌，应尽快进行检测。（3） 本实验采用增菌液两步增菌,并使用了选择性强、特异性高的分离培养基,克服了传统李斯特菌检测方法检测周期较长、所需试剂繁多、菌落生长慢

23、等缺点,使李斯特菌的检测更加快速、简便、特异、敏感。该方法使李斯特菌检测具有更好的适用性和可操作性18。3.3 金黄色葡萄球菌的检测结果 3.3.1 检测结果 图5 检测金黄色葡萄球菌的BP平板 金黄色葡萄球菌的BP平板如图5所示，检测平板中有黑色菌落出现。因此进行了下一步的血浆凝固酶试验检测。血浆凝固酶试验的判断标准见图6。所试样品血浆凝固酶试验时未发生凝固，呈水状，结果为阴性，如图7。 图6所示为血浆凝固酶试验阴性、阳性判断标准 图7 血浆凝固酶试验 结论：综合菌落形态和血浆凝固酶结果，报告每25g样品中未检出金黄色葡萄球菌，所检样品为合格的产品。3.3.2 结果分析（1） 由于原料虾的来

24、源是每年收虾季（9月-11月）冷冻储存下来的。所以后期产品都经过长期冷冻，而BP平板中长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落黑色较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥19。 （2） 做血浆凝固酶试验时，要共观察6 h，隔半小时观察一次，一般2 h-4 h凝固，培养时间过长凝固后因菌体生长较多或液化而溶化，造成结果判定的准确性。 （3） 金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素20，肠毒素可耐受100 煮沸30 min 而不被破坏。应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超6 h。夏季从车间取样到化验室最好避开阳光。

25、（4） 金黄色葡萄球菌在自然界中可以说无处不在，大气、土壤、灰尘、水及人和动物的排泄物中都可找到，有25 %- 40 %的人群为健康携带者(存在于皮肤、鼻子、咽喉等处)。由此可见，在面包虾的整个生产、检测过程都极易引入金黄色葡萄球菌。这需要工作人员做好着装和消毒工作。3.4 副溶血性弧菌的检测结果3.4.1 检测结果 样品中副溶血性弧菌检测的显色平板如图8所示，样品3 %氯化钠三糖铁琼脂检验结果表明（图9，表1）。结论：综合菌落形态和生化特征，报告每25 g样品中未检出副溶血性弧菌为合格的产品。 图8 弧菌的显色平板 图9 3%氯化钠三糖铁琼脂 表1 3 %氯化钠三糖铁琼脂检测结果3 %氯化钠

26、三糖铁琼脂检测判断结果斜面底层产气硫化氢有无动力菌株AA无非副溶血性弧菌注：K：产碱，A：产酸；+：阳性；：阴性；+（）：多数阳性，少数阴性；+/：阴性或阳性3.4.2 结果与分析（1） 溶血性弧菌有海洋细菌之称。主要来自海产品，如鱼、虾、蟹、贝类和海藻等。从弧菌显色平板可以看出明显的品红色的疑似菌落。取该菌落接种于3% 氯化钠三糖铁琼脂，其结果不符合副溶血性弧菌底层不变黄，不变黑，无气泡，斜面颜色不变或红色加深，有动力的特点14。所以该样品中未检出副溶血性弧菌。（2）副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快17，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡。所以检测时既要防止待检材料冷冻导致副溶血性弧菌

27、受伤濒死，也要注意室温下该菌可以生长繁殖。4 结论常规的微生物学检验通常以分离培养、生化试验及血清学试验来进行判断。传统的检测方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高；但涉及的实验较多、操作繁琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，还要有大量人员参与。而且无法对难以培养的病原菌进行检测，因此病原微生物的检测结果往往存在不同程度的滞后性。这不仅不利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果，也不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正和处理措施21。要想生产优质的产品，必须要有良好的卫生。要做好卫生监控的好与坏，除了遵守SSOP等基础生产操作规范以外，还要靠微生物检测来衡量卫生是否合格，卫

28、生不合格，产品的微生物污染的风险就会增高，产品不合格率就会提升。如果生产出来的都是不合格品，企业就要提高生产成本来重新处理不合格品，所以，微生物检测作为卫生的监督员，至关重要，它把良好的生产卫生控制在生产过程中，降低了微生物污染的风险，提高了产品的合格率，降低了公司的成本。面包虾的检测是及其重要的，其产品都要达到国家标准要求。对于致病菌有很多种检测方法，我们在检测中要选择合适且能达到国家标准的方法进行检测。对于企业来说，讲究的是利润，所以想要在质量检测和品质控制这一模块提高效益，要在条件允许的情况下，建立比较正规的实验室，运用先进的仪器设备。不但检测速度高效便捷，而且一定程度地节约了人力、物力

29、，从而为企业带来更大的效益。5 实习心得体会我来到这里实习已经有二个多月的时间了，在实习的这段日子里，让我体会到了很多，最大的满足就是学到了很多的书本以外的知识和处世的道理。这个工作不仅仅需要感清晰，更需要果断的判断力，不能有一点点的马虎。日积月累经验也就多了不少，这些都是我在书本上学不到的。刚开始上由于和别人一起工作都是别人做着我看着，并没有感受到工作所带给我的压力，当有一天我自己独立工作的时候才真正体会到了自己肩上的担子有多么的重，体会到了作为一名化验员所承担的责任。公司里的领导对待员工都很好。在我们完成了自己工作的前提下，可以有自己的空间，做一些自己喜欢做的事情。公司的领导对待员工就象自

30、己的亲人一样，员工之间相处的也很融洽。在这样的环境下工作是比较轻松和愉快的，这样我们会更加热爱自己的岗位和工作。我能有今天的收获要感谢公司给我的这次工作的机会，是公司让我学会了很多的东西。也要感谢领导对我的信任和关心，让我圆满的完成了这次实习任务并获得了工作的机会。我能有今天的收获要感谢公司领导给我的这次工作的机会，是公司让我学会很多东西，我将在今后的工作中，更加努力的。参考文献1 蔡特.关于食品微生物检测问题分析J. 健康必读杂志,2011,2(2):226.2 中国工程院医药卫生学部编, 中国食品安全M. 北京：中国协和医科大学出版社，2007,30(10):13-14.3 胡全胜. 一起

31、沙门氏菌和副溶血性弧菌引起食物中毒的调查和分析J.山东医学高等专科学校学报,2011,5:341-342.4 郭桂萍，葛红梅，王匀，张文国，倪鹏. 单增李斯特菌检测技术研究进展J，中国食物与营养2011, 17(3):12-15.5 姚勇芳. 食品微生物检验技术M. 北京：科学出版社，2011. 67-69.6 林洪. 水产品安全性M. 北京：中国轻工业出版社，2005. 21-25.7 James M. Jay 编著，徐岩等译. 现代食品微生物学 M.北京：轻工业出版社，2001. 94-97.8 陈红霞，李翠华主编；食品微生物学及实验技术M. 北京：化学工业出版社，2008. 11-17.9 陈思强，钟伟强，曾振兴，等.自动酶联荧光免疫分析系统检测冻肉中沙门菌的评价J中国国境卫生检疫杂志,2004,27(5):309.10 韩北忠，李敏，张琳，张娜. 预测微生