蛋白质的检测和分离

1、会计学1蛋白质的检测和分离蛋白质的检测和分离第一节 引言第二节 前处理第三节 蛋白质的粗分离第四节 蛋白质的层析分离第五节 蛋白质的电泳分离第六节 蛋白质的结晶第七节 蛋白质的检测 一、根据蛋白质溶解性的差异分离有机溶剂1.透析透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法 。只用于除盐类和小分子杂质二、根据蛋白质分子大小的差异分离2.超过滤：应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质加压蛋白质溶液半透膜超滤液支持膜的栅板滴加样品4 %8 %12%16%20%塑料离心管蔗糖密度梯度（介质还可用：

2、氯化铯、甘油等）蔗糖浓度%分子量由小 大3.密度梯度离心：蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小，也决定于它的密度。若它在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的较快，每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度时，即停止不前。一、层析概述 层析分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。凝胶过滤原理吸附层析疏水层析分配层析亲和层析离子交换装置选择上样和洗脱结果检测 上样均一性 洗脱装置目的不同 检测方法不同活性检测基质均

3、匀性柱层析的L/d比值v 不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置 分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。递减递增pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂离子强度疏水层析离子交换层析 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱

4、液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。线性梯度洗脱装置性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱v与微机、质谱等连用共价结合u平衡离子是结合于配基上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。u阳离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂，能与带正电的离子基团发生交换作用u阴离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂，与带负电的离子基团发生交换作用NH3RCOOH +NH3RCOO+-RNH2COO -Low pHPositive chargeHigh pHNegative chargeHydro

5、gen gainedHydrogen lost离子浓度增加+配基结构pK分类简称硫酸基(sulphate)-OSO3H 2强酸S磺酸基(sulphonate)-(CH2) nSO3H 2强酸SM(n = 1) ，SE(n = 2) ，SP(n = 3) ，SB(n = 4)磷酸基(phosphate)-OPO3H2 9强碱Q ，QAE离子交换剂的基质 琼脂糖离子交换剂 离子交换交联葡聚糖聚苯乙烯离子交换纤维素 1、离子交换纤维素交换剂名 称（纤维素）作 用 基 团特 点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N

6、+(C2H5)3氨乙基AE+-O-C2 H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在pH4以上磷酸P-O- PO2 用于低pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基SE-O-C2H4-SO3强酸性用于极低pH优点：u开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，吸附容量大，通透性好，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。u亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 u回收率高 缺点：u交换剂膨胀2、交联葡聚糖类 型性 能离子基因反离子总交换容量（毫克

7、当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl3.00.4QAE-sephadexA-50CM- sephadex C-25弱碱性、阳离子交换剂CMNa+4.50.5CM- sephadex C-50SP- sephadex C-25强碱性、阳离子交换剂SPNa+2.30.3SP- sephadex C-50u不会引起被分离物质的变性或失活u非特异性吸附u交换容量大 u同时具有分子筛效应离子交换葡聚糖的选用： 一般根据蛋白质的分子量而定u中等分子量（30

8、000-200000）一般选A50和C50u低分子量（30000）和高分子量（200000） 均宜选用A25和C25。交换剂名 称特点阴离子交换剂DEAE-Sepharouse CL-6B弱碱性 pH:2-14DEAE- Sepharouse Fast FLow阳离子交换剂CM- Sepharouse CL-6B弱酸性 pH:2-14强阴离子交换剂交联度为4%颗粒度为50-100目缓冲液的选择 层析柱的选择 洗脱流速加样 洗脱洗脱液的监测收集及组分鉴定 离子交换剂的清洗、再生和保存 离子交换剂的处理 离子交换剂的选择价格分辨率和稳定性特点纤维素离子交换剂较低较低适于初步分离和大量制备葡聚糖离子

9、交换剂适中适中受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率琼脂糖离子交换剂较贵较高稳定、分辨率高、吸附量大分辨率平衡时间流速应用小颗粒高长慢需要高分辨率的分析或分离大颗粒低短快分辨率要求不高的大规模制备性分离u 膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。u水悬浮去除杂质和细小颗粒清洗p金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCl（即pH=2）处理柱子p沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。25mmolL的乙酸钠缓冲液充分透析血浆 用乙酸将血浆的pH调

10、至5.2 ，除去沉淀 上阴离子交换柱 pH 5.2的乙酸缓冲液洗脱等电点较高的Ig G pH为4.5的同样浓度的同一缓冲液，以阶段洗脱的方式得到HSA 降低pH至4.0，同时升高缓冲液的浓度至150 mmol /L，洗脱得到其他的糖蛋白 用DEAE-Sepharose CL-6B柱大量分级人血浆蛋白 表 鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析级分中的蛋白质pI洗脱缓冲液的pH洗脱峰pH 产量（mg） 活性回收（%）A拟卵粘蛋白3.9-4.34.34.342.287B拟卵粘蛋白3.9-4.34.44.40.9C卵蛋白A14.58 4.554.5173.889D卵蛋白A24.65 4.75

11、4.6537.2E卵蛋白A34.755.0 4.8511.0F“球蛋白”5.55.23.6G卵转铁蛋白6.5-6.86.05.842.587H卵转铁蛋白6.5-6.86.76.116.1I“球蛋白”8.58.07.5J“球蛋白”9.59.32.4K“球蛋白” 10.09.41.1L抗生物素蛋白10 10.09.50.939M“球蛋白” 10.09.91.2N溶菌酶 10.0 10.02.192Ve 洗脱体积Vo 外水体积Vi 内水体积洗脱行为可以有三种可能的情况: 凝胶Kd0Kd=l0Kd9810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.5150015003198

12、10(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-10000048

13、53434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)v优点： 物理化学稳定性高，耐热耐压，使用寿命长v缺点： 柱效较低 、表面具有离子性，对蛋白质有吸附性、不能在强碱性环境中使用 刚性亲水性填料，具有一定直径的多孔网状结构的球状颗粒优点缺点小颗粒分离效果好流速慢 分离时间长大颗粒流速快区带扩散 洗脱峰平而宽v柱L/D值的选择v洗脱液用醋酸铵等挥发

14、性盐类缓冲液使层析柱平衡上样用同样缓冲液洗脱收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类对于盐浓度低时易沉淀的蛋白质：交联葡聚糖凝胶G-50柱(1.8cm100 cm)用50m mol/LTris-HCl, pH 7.8缓冲液平衡天花粉硫酸铵糊(90饱和度的沉淀)溶于2m1平衡缓冲液中上样洗脱天花粉毒蛋白除去不溶物测大于所用载体上限分子的洗脱体积测小于下限的分子的洗脱体积标定凝胶过滤柱的Vo标定凝胶过滤柱的Vi测定一系列已知分子量的标淮样品在柱上的洗脱体积Ve以(Ve-Vi)(Vo-Vi)和1ogMw 作图测得了待测分子量的样品的Ve从标准曲线上可以求得未知样品的分子量蓝色葡聚糖氨基酸、有色盐类以标

15、准样品的分子量的1ogMw对Ve作图 or洗脱液中蛋白质浓度将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外离心或过滤，去除溶胀的凝胶浓缩的高分子溶液变性蛋白加入凝胶柱高浓度变性剂存在，蛋白呈无规则卷曲变性蛋白体积大，只能进入颗粒间隙，迁移速度快变性剂分子量小，进入颗粒内部，迁移速度慢缓冲液洗脱蛋白变性剂浓度降低，转成复性缓冲液变性蛋白复性，以天然形态洗脱出柱Water moleculesSoluteSurface exposedhydrophobicgroupsLigandWater moleculesin bu

16、lk人工合成聚合物类琼脂糖纤维素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯类多糖类壳聚糖 应用最广泛 良好的生物相容性和化学稳定性 芳基配基 高分子配基 v平衡 Equilibrationv上样 Sample applicationv洗杂 Washingv洗脱 Elution1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionWater moleculesHydrophobic ligandGel matrix1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionGel matrixProtei

17、nsHydrophobic groups 1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsNon-bound proteins1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionTarget elutesConc. saltAbs1. Equilibration2. Sample application3. Washing4. ElutionConc. saltAbsMore strongly bound proteinsv最常用的盐： (N

18、H4)2SO4 、Na2SO4 和NaCl洗脱时，洗脱液pH逐渐升高。优点优点缺点缺点纤维素纤维素价格低、活性基团较多价格低、活性基团较多非特异性吸附强、稳定非特异性吸附强、稳定性和均一性较差性和均一性较差交联葡聚糖交联葡聚糖稳定性较好稳定性较好孔径较小、稳定性不好孔径较小、稳定性不好聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺同上同上同上同上非特异性吸附低、稳定性好、非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化孔径均匀适当、宜于活化多孔玻璃多孔玻璃机械强度好，化学稳定性好机械强度好，化学稳定性好活性基团较少、对蛋白活性基团较少、对蛋白质有较强的吸附作用质有较强的吸附作用 指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表

19、面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质配体配体待纯化的蛋白质待纯化的蛋白质抗原抗原特定单克隆抗体或多特定单克隆抗体或多克隆抗体克隆抗体肝素肝素凝聚因子、脂酶、结缔凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、组织蛋白酶、DNA聚聚合酶合酶单克隆抗体单克隆抗体特定抗原特定抗原胆固醇胆固醇胆固醇受体、胆固醇结胆固醇受体、胆固醇结合蛋白合蛋白蛋白质蛋白质A/蛋白蛋白质质G免疫球蛋白免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸脂肪酸结合蛋白、白蛋脂肪酸结合蛋白、白蛋白白蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂蛋白酶蛋白酶核苷酸核苷酸核苷酸结合蛋白、需核核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶苷酸的酶磷酸磷酸磷酸酶

20、磷酸酶苯基硼酸苯基硼酸盐盐糖蛋白糖蛋白三嗪染料三嗪染料脱氢酶、激酶、聚合脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素酶、限制酶、干扰素凝集素凝集素糖蛋白糖蛋白抗生物素蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶含生物素的酶糖糖凝集素、糖苷酶凝集素、糖苷酶蛋白质亲和层析中的合适配体特异性洗脱1.流程(1) 高压输液泵l 主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)。电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳（e

21、lectrophoresis）。电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年俄国物理学家Ress进行了世界上第一次电泳实验）。但电泳技术的广泛应用，则是在1937年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。一、概述（一）概念原则上按电泳的原理来分，可分为二类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩

22、散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。一、概述（二）分类（三）基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH、电渗及离子强度多种因素的影响。一、概述二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学

23、性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N, N-甲叉双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH(

24、 )n( )n( )m( )m1. 聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶聚合为自由基聚合，其催化体系有两种： 1）化学聚合 化学聚合的催化剂（引发剂）通常采用过硫酸铵（ammonium persulfate，Ap），此外还需要加速剂TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可促使过硫酸铵形成自由基： S2O82- 2SO4- 这些自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。2）光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速

25、聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。2. 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T =

26、凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。 对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面： 1）凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶（23），下层为小孔径的分离胶

27、（ 515 ）。 2）缓冲液离子组成的不连续性。主要是阴离子不同（Gly-, Cl-）。 3）凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9 的Tris-HCl缓冲液。 4）在电场中形成不连续的电位梯度。 在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。Tris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率

28、，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差异就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。 SDS的作用原理 lSDS能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分子部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。 l当SDS的总量为蛋白量的310倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。 l蛋白质分子一经结合了一定量的SDS

29、阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。l不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭球状。 l在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。 测定蛋白质分子量p当蛋白质的分子量在17,000165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=lgKbm p将已知分子量的标准蛋白质在SDS -聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率对

30、分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。四、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，IEF-PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶中加入一种合成的两性电解质载体，在电场的作用下会自发形成一个连续的pH梯度。蛋白质样品在电泳中被分离，运动到等电点胶层时就失去所带电荷而稳定停留在该处，样品中不同蛋白质组分等电点不同，因而在等电聚焦电泳中得到有效分离。在等电聚焦电泳中，利用各蛋白质组分等电点的差异，并不利用凝胶的分子筛作用。它的分辨力高，可分离等电点相差0.01-0.02pH单位的蛋白质。pH梯度形成的机制 在溶液中的两性电解质一方面受溶液pH值的影响，决定其带电的性质；另一方面，它又影响周围环境（水溶液），使其pH值有所改变。 在制备聚丙