蛋白质及氨基酸的测定

1、会计学1蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定 由19世纪丹麦化学家Kieldahl首先提出。 它是测定蛋白质最常用的方法，也是测定总有机氮最准确和操作简单的方法之一。 适用范围：此法只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，可得蛋白质含量，由于样品中常含有非蛋白质的含氮化合物，因此常将测定的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法A、凯氏烧瓶规格：50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml特点：瓶颈长、耐高温B、常量凯氏定氮装置实验原理实验原理 蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜作用产生颜色反应，生产紫红色配合物，称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有的肽键与双缩脲结构相似，因此也能发生上述

2、反应，生成紫红色配合物。优缺点优缺点 不受温度影响，但灵敏度低仪器：分光光度计；离心机试剂：碱性硫酸铜溶液；四氯化碳读数时要注意读的是A的值；注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）；准确记时。注意事项注意事项紫外分光光度计法.将透明液置于比色皿中，以8mol/L尿素的2mol/L氢氧化钠溶液作参比液，在280nm波长处测定各溶液的吸光度值A。以凯式定氮法测得样品中蛋白质的质量为横坐标，上述吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物），蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色

3、法测定。实验原理实验原理 吸取一定量的样品稀释液，加入福林酚试剂甲3.00ml，置于25中水浴保温10min，再加入福利-酚试剂乙0.3ml，立即混匀，保温30min，以介质溶液调零，于750nm波长下测定溶液的吸光度A，与蛋白质标准液作对照，求出样品的蛋白质含量。 本法在060mg/L蛋白质范围内呈良好的线性关系。 福林-酚法的灵敏度比双缩脲法高100倍，肽键显色效果增强，减少了因蛋白质种类引起的偏差。 该法由于两步呈色反应可以叠加，其灵敏度特别 高，所以适用于20250ug微量蛋白质的测定，可检测的最低蛋白质量为福林-酚法试剂配置繁琐耗时。 酚试剂仅在酸性条件下稳定，由于此实验的反应只在P

4、H=10时才发生，所以加酚试剂时必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。说明：说明：测定 吸取样品稀释液2ml，加染料试剂2ml,混匀，以介质溶液调零，于620nm波长下测定的吸光度A，与蛋白质标准液对照，求出样品蛋白质含量。(3)干扰素物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Tris缓冲液、甘油等均不干扰此测定法。单指示剂甲醛滴定法单指示剂甲醛滴定法优点优点：简单易行，快速方便缺点缺点：Pro与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；Tyr含有酚羟基，滴定时会消消耗一些碱使结果偏高；溶液中有铵则可与甲醛反应使结果偏高。适用范围适用范围：用于各

5、类样品游离AA含量的测定 由于本法采用了0.1%百里酚酞作指示剂，样液需先用NaOH标准溶液滴定到淡蓝色后再加40%中性甲醛，若不中和则会造成测定结果误差。原理 由于氨基酸为两性结构，向AA的溶液中加入甲醛溶液，十七碱性消失，这时可以用标准强碱溶液滴定，后计算出AA的量。试剂40%中性甲醛溶液（用百里酚酞作指示剂，用NaOH将40%甲醛中和至淡蓝色）0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1mol/LNaOH标准溶液测定 1、吸取待测液50mL于250mL锥形瓶中，加 0.1%百里酚酞指示剂23滴 2、用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定到淡蓝色，再加40%中性甲醛溶液20mL 3、摇匀静止1min,继

6、续用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色，记录第二次滴定所消耗的NaOH溶液的体积V.双指示剂甲醛滴定法双指示剂甲醛滴定法原理原理 氨基酸具有酸性的COOH基和碱性的NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。试剂试剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 百里酚酞乙醇溶液：1g/L。 中性红50%乙醇溶液：1g/L。氢氧化钠标准溶液：0.1mol/L操作方法操作方法 移取含氨基酸约2030mg的样品溶液两份，分别置于

7、250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/LNaOH标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液体（mL）。结果计算结果计算式中 X-氨基酸态氮的含量，g/100g； c -氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L； V1-用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL； V2-用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL； m-测定用样品溶液相当于样品的质量，g； 0.014-氮的毫摩尔质量，g/mmo

8、L。100014. 0)(12mcVVX电位滴定法电位滴定法(1) 原理原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。(2) 酚酞乙醇指示液：1%硼砂（标准物质）缓冲液：PH9.22 称取3.8克Na2B4O7 溶解后，定容至1000mL中性甲醛溶液：%氢氧化钠标准溶液：0.0500mol/(4) (4) 试验步骤试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，

9、开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。 同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧杯中，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。操作方法标准曲线的绘制准确吸取200ug/ml的氨基酸标准溶液0.0ml、0.5ml、1.0m

10、l、1.5ml等，分别置于25ml比色管中，个加水至容积为4.0ml，然后加入2%茚三铜溶液和pH为8.04的磷酸盐缓冲液各1ml，混合均匀后于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，定容，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定各溶液的吸光度A値。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项茚三铜受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前需进行纯化。试剂1. 1%的氧化镁混悬液2. 20%的硼酸指示剂测定1、样品处理2、蒸馏吸收3、滴定结果计算C-盐酸标准溶液的浓度，mol/lV1-滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积。M-样品质量，gV0-滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液浓度，g/mmol注意事项1、滴定重点的观察，应注