南开大学 分子生物物理-生物分子的相互作用

1、第一章 蛋白质分子的结构蛋白质的功能催化功能催化功能运输功能运输功能防御功能防御功能收缩和运动功能收缩和运动功能结构功能结构功能信号传导和调控功能信号传导和调控功能遗传和发育遗传和发育蛋白质结构层次从高到低的形成过程蛋白质结构层次从高到低的形成过程第二章 蛋白质的折叠蛋白质的合成过程定义：蛋白质折叠是多肽链凭借相互作用在细胞环境（特定的酸碱度、温度等）下自己组装自己，从无规卷曲（去折叠态）折叠到三维功能结构（天然态）的物理过程。Anfinsen的经典热力学假说： Anfinsen认为天然蛋白质多肽链所采取的构象是在一定环境条件下（如溶液组分、pH、温度、离子强度等），整个系统的总Gibbs自由

2、能取最低，所以处于变性状态的多肽链能够在这样的环境下自发折叠成天然构象。n分子伴侣n折叠酶n分子内伴侣n Ellis1987年提出了蛋白质“辅助性组装学说”。相对于“自组装”学说，认为蛋白质多肽链的正确折叠和组装需要其他蛋白质分子的帮助。第三章 生物分子的相互作用3.1 分子内与分子间的相互作用力n相互作用的一般知识n强相互作用n弱相互作用n水结构与水化作用3.1.1 相互作用的一般知识 生物分子以及由它们所组成体系的功能和其结构密切相关，而这种结构之所以能够维持取决于分子内部基团之间或者分子之间的各种相互作用力。用化学语言说，就是存在各种主键（共价键、配位键）和次级键（氢键、范德华力、疏水相

3、互作用）。 主键：强相互作用，热稳定，维持原子结合，形成一级结构。 次级键：弱相互作用，单独或少数次级键将由热运动而被破坏。但大量次级键决定生物大分子的空间结构，既可保持稳定性，又有较大的灵活易变性。 如蛋白质维持一级结构靠原子之间的共价结合（包括二硫键），维持二级结构例如-螺旋、-折叠则依靠氢键等。氢键和共价键相比要弱得多，因此加热或其它不很剧烈的方法就能使之断裂。但由于氢键数量较多，它在维持整个分子的空间结构方面仍起很重要作用，只有一定数量的氢键都受到破坏，才能使结构改变，分子丧失其活性。因此研究研究结构以及结构与功能的关系都必须以对相互作用力的了解作为基础。 此外，生物体内存在着大量特异

4、相互作用，在药物、激素和细胞膜上的某些分子（如受体）之间，酶与其底物之间，以及抗原和抗体之间，都有这种特异相互作用。特异相互作用是识别（recognition）现象的基础，并且是生命现象区别于非生命过程的一种特征。所以相互作用力的研究对于了解药物、激素、酶、抗体等的作用机理具有十分重要的意义。当热运动时各种分子被带到一起，那些表面当热运动时各种分子被带到一起，那些表面形态相匹配的分子正确地靠拢。促使大分子形态相匹配的分子正确地靠拢。促使大分子形成发生特异相互反应的一些非共价键包括形成发生特异相互反应的一些非共价键包括氢键和范德华力。氢键和范德华力。 分子内与分子间相互作用的意义：维持大分子的结

5、构 分子间特异的相互作用（识别）实际上两个原子核之间还有斥力，由于斥力而产生的势能按指数规律变化：势能与势能曲线直接测定两个原子或分子之间的力很困难，但在许多情况下常常可测定相互作用的能量。例如当Na+与Cl-相距无限远时，可认为相互作用力为0，因此可以任意规定此时体系所具有的势能为0。而当这两个离子由于引力作用彼此接近到相距为r时，其势能为：因此整个体系势能为E1与E2之和，即：E和r的关系按上式绘成图，称为势能曲线。斥力和引力平衡时势能曲线出现最小值。 键能 键能指分开原子系统的势能与结合原子系统的势能之差，可通过各种物理和化学方法测定，因此研究相互作用能比相互作用力更为方便。 一般把相互

6、作用分为强和弱两类，其标准是分子热运动对它的影响。强相互作用不易受热运动影响，而弱相互作用则易为热运动所削弱或破坏。分子热运动的平均能量为kT（T为绝对温度，k为波尔兹曼常数），在体温（310K）下此值约为2.51103J/mol。强相互作用远大于此值，弱相互作用与其同数量级。 强相互作用：共价键、离子键、配位键 弱相互作用：氢键、范德华力、疏水力 3.1.2 强相互作用意义： 维持原子结合，形成一级结构包括：共价键 离子键 配位键一、共价键（covalent bond） 是化学键的一种，原子互相接近形成分子时共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构叫

7、做共价键。其本质是原子轨道重叠后，高概率地出现在两个原子核之间的电子与两个原子核之间的电性作用，原来分属不同原子的电子云重新组合成属于由这两个相互作用的原子所组成体系的新的电子云分布，或者说，原子轨道改变为分子轨道。 由于电子的微观属性，共价键的形成不能简单的用库仑静电相互作用来说明，需要用量子力学的理论才能给出合理解释。1. 共价键的形成图分子轨道和原子轨道的原始状态有关，如两个氢原子外围各有一个1s轨道，形成共价键时可得到两种分子轨道，一种为成键轨道，另一种为反键轨道。这两种轨道都对于联结两个原子核A和B的键轴对称，称为键。成键轨道两核间电子云密度大，称为 轨道，反键轨道两核间密度小，称为

8、 *轨道。每个键中有两个电子，成键轨道能量较低，反键*轨道能量较高。能层能层n一一二二三三四四符号符号KLMN能级能级sspspdspdf轨道数轨道数1131351357最多容最多容纳的电纳的电子数子数22626102610 142818322n2 能层、能级、原子轨道能层、能级、原子轨道键（sigma bond）n由两个原子轨道沿轨道对称轴方向相互重叠导致电子在核间出现概率增大而形成的共价键，叫做键，可以简记为“头碰头”。一般的单键都是键。由于键是沿轨道对称轴方向形成的，轨道间重叠程度大，所以，通常键的键能比较大，不易断裂，而且，由于有效重叠只有一次，所以两个原子间至多只能形成一条键。键（p

9、i bond） n成键原子的未杂化p轨道，通过平行、侧面重叠而形成的共价键，叫做键，可简记为“肩并肩”，其中的电子称为电子。键与键不同，它的成键轨道必须是未成对的p轨道。两个原子间可以形成最多2条键，例如，碳碳双键中，存在一条键，一条键，而碳碳三键中，存在一条键，两条键。 原子轨道电子云密度的几何图形 键与 键s-s, s-p, p-pp-p成键能力n s，p，d 轨道电子的相对成键能力：n 成键能力大的轨道形成的共价键牢固，因此，p-p成键s-s成键。5,3, 1dpsfff2. 共轭体系生物大分子中存在大量的共轭体系嘌呤嘧啶芳香族氨基酸磷酸根生物大分子中共轭体系的意义二 离子键离子键与生物

10、大分子的识别有关：三 配位键3.1.3 弱相互作用作用：维持大分子的空间结构包括：氢键、范德化力形成：有些与偶极子的存在有关静电相互作用12123, U=q qq qFrrr1 电荷电荷电荷相互作用电荷相互作用乙酰胆碱脂酶对Ach水解包含了各种相互作用强相互作用起定位作用，弱相互作用决定其排列偶极子-偶极矩各种电相互作用及E与r的关系n电荷-电荷n电荷-偶极子n偶极子-偶极子n电荷-诱导偶极子n偶极子-诱导偶极子31rr121r61r41r2 电荷电荷偶极相互作用偶极相互作用3()qUrr -q+qqrxy3 偶极偶极偶极相互作用偶极相互作用1212323()()1, rrUlrrr 12rl

11、r4 电场诱导作用电场诱导作用-诱导偶极子诱导偶极子 以上讨论的相互作用，都涉及电荷的非对称分布，即正、负电荷的重心不重合，由于正负电荷吸引而在电场中储存能量。 正负电荷重心重合的中性分子或基团，在外电场的诱导下，亦会出现极化现象，从而形成诱导偶极子。诱导偶极子与电场相互作用而储存能量，这种相互作用称为电场的诱导作用。 电场的诱导作用包括电荷诱导偶极相互作用和偶极诱导偶极相互作用。短程力n短程力（short-range force）是原子或基团接近到很短距离时明显出现的作用力。n1、当离子与分子接近时，相互间即逐渐产生静电作用。n2、分子和分子间也可发生相互作用。这种相互作用可以发生在偶极与偶

12、极之间，偶极和诱导偶极之间及诱导偶极之间，这些作用力统称为范德华力。 氢键除共价键之外的最强的稳定因素 氢键相对强度比较弱，一般在40kJ/mol以下，而共价键一般都是数百kJ/mol。单个氢键很容易被热扰动所破坏，但它们数量很大，故在稳定水结构和蛋白、核酸结构方面都有极其重要的意义。氢键的本质n电荷相互作用n电负性 : X, Y电负性要求大nX-H: 氢的给体nY: 氢受体YHXH2O既是给体又是受体氢键可在分子内形成 （分子内氢键）范德华力 早在1873年，Van der Waals就注意到在物质的聚集态中，分子间存在一种远比化学键弱的吸引力，这种引力是导致实际气体不完全符合理想气体定律的

13、原因之一，后人因此把分子间的引力称为范德华力。 广义的范德华力：偶极相互作用 (Keesom力)、诱导相互作用(Debye力)、色散相互作用 狭义的范德华力：色散相互作用(London力) 两个非极性分子之间也存在相互的吸引，这种吸引主要是色散相互作用。 一个非极性分子没有永久偶极矩，但由于电子的运动，他可以有一个瞬时非零的偶极矩，但在测量的时间间隔内平均偶极矩为零。这种瞬时偶极矩诱导相邻分子产生诱导偶极矩，从而在分子间产生相互吸引。 London推出，两分子间色散相互作用的近似表达式： I1, I2为两个分子的电离能，1, 2为两个分子的极化率诱导偶极-诱导偶极6212121r23IIIIU

14、色散力一般比较弱，但在非极性分子间，这种相互作用占主导地位。以下两个效应可以使色散相互作用得到加强：1. 累加效应：一个分子可以有多个瞬时偶极矩，他们都可以诱导另一个分子产生一个偶极矩，总的相互作用是一种累加效应。2. 位相效应：当两个分子相同时，具有相同的固有频率，故瞬时偶极矩能够精确的同位相，从而产生最大的相互作用。即，色散相互作用倾向于把类似的分子拉到一起，产生稳定由相同亚单位组成的大分子。弱相互作用的生物学意义 维持大分子的空间结构与细胞膜的结构 在分子识别过程中有重要意义3.1.4 水结构与水化作用水的结构单个水分子的四面体结构单个水分子的四面体结构中心水分子与周围四个水分子的空间关

15、系中心水分子与周围四个水分子的空间关系盐溶于水后发生了明显的物理变化。n CaCl2溶于水后，盐溶液的比热比水小n NaCl溶于水后，总体积缩小体现了溶液的非理想性包括极性基团的水化作用原因：破坏了水的结构，两个现象都可解释离子的水化作用离子的水化作用n水化作用（hydration）是物质与水发生化合的反应，又称水合作用，一般指分子或离子的水合作用。其中当盐类溶于水中生成电解质溶液时，离子的静电力破坏了原来的水结构，在其周围形成一定的水分子层，称为水化。 离子水化模型n根据X射线衍射分析，液态水是微观晶体，在短程和短时间内具有与冰相似的结构，即1个中心水分子周围有4个水分子占在四面体的顶角包围

16、着它，四面体结构是通过氢键形成的。5个水分子没有占满四面体的全部体积，是一个敞开式的松弛结构。离子溶入水中后，离子周围存在着一个对水分子有明显作用的空间，当水分子与离子间相互作用能大于水分子与水分子间的氢键能时，水的结构就遭到破坏，在离子周围形成水化膜。紧靠离子的第一层水分子定向地与离子牢固结合，与离子一起移动，不受温度变化的影响。第一层以外的水分子也受到离子的吸引作用，使水的原有结构遭到败坏，但由于距离稍远，吸引较弱，与离子联系较松。 nI区：初级水化层，区：初级水化层，水分水分子与离子有直接静电相互子与离子有直接静电相互作用，作用，与离子结合在一起与离子结合在一起作整体移动，数目取决于作整

17、体移动，数目取决于阳离子种类。阳离子种类。nII区：区：中间层原来的水结中间层原来的水结构遭到破坏，水结构的有构遭到破坏，水结构的有序取向趋势与离子辐射状序取向趋势与离子辐射状的电场作用相互竞争。的电场作用相互竞争。无无结构水，结构程度最小，结构水，结构程度最小，熵最大。熵最大。nIII区：体积水（容积水），区：体积水（容积水），正常的微晶结构水。正常的微晶结构水。n离子水化作用产生两种影响，一是离子水化作用减少溶液“自由”水分子的数量，增加离子体积，因而改变电解质溶液中电解质的活度系数和电导性质。这是溶剂对溶质的影响；二是离子水化往往破坏附近水层中的正四面体结构。降低离子邻近水分子层的相对介

18、电常数，这是溶质对溶剂的影响。 像蛋白质这类生物大分子，除了其主链有一定的偶极矩外，侧链也有极性或离子基团，因而水分子必然与其有相互作用而影响生物大分子的构象和功能。n极性基团暴露在水中，就会发生象离子那样的水化作用；n非极性基团暴露在水中，会发生疏水化作用。疏水相互作用笼形结构 如果蛋白质侧链的一个离子基团暴露在水中，可以预期，在该局部会产生如无机离子那样的水合作用；相反如果一个疏水基团从蛋白质表面伸出，它会使周围容积水的结构产生空缺，形成笼状结构。侧链中的离子（或极性）基团与其它疏水键的距离会对水结构有不同影响。 由于蛋白质的疏水键和极性键与水有相反的作用，所以一般而言，蛋白质在水中形成高

19、级结构时，总是尽可能地把疏水侧链卷缩到其内部，而有离子化或偶极子的侧链伸展到水溶液中。 但是由于蛋白质构象内部仍会有极性基团发生某种程度的离子化，因而在蛋白质结构内部也会有少量的水分子与这些基团相络合。 水结构的生物学意义：与蛋白质的功能的关系与蛋白质的功能的关系蛋白质的疏水侧链一般位于蛋白质分子内部，而极性或偶极性侧链在外，能和水相互结合，有时甚至结合得很紧密，以致这一层结合的水和蛋白质分子成为一个整体，进而影响蛋白质的功能。疏水物质的笼形结构与生物学功能疏水物质的笼形结构与生物学功能一些化学不活泼物质（如氯仿CHCl3，氧化亚氮N2O、二氧化碳CO2、环丙烷C3H6、氙Xe、氩Ar等）麻醉

20、作用机理的研究。机理：进入体内溶液中的这类物质能使其周围的水分子形成笼状结构，这种水结构是晶态的，它会阻碍神经细胞膜对离子的通透。 肿瘤细胞与正常细胞的差异3.2 生物分子间的相互作用ProteinDNARNAOthers The interaction of biomacromolecules is the fundamental basis of any cellular functionProteinothersDNARNAInteraction3.2.1 蛋白质分子的相互作用n蛋白质分子之间发生的相互作用对其发挥生物学功能具有非常重要的作用，如：n抗原与抗体结合免疫反应n肌球蛋白与肌动

21、蛋白相对滑动肌肉收缩n配体（多肽激素）与受体结合生理效应n蛋白抑制剂与酶结合抑制酶活性n分子聚合（有功能蛋白质）n分子识别（抗原抗体、配体受体、酶底物）n分子装配（病毒）n多酶复合体n蛋白质复合物（细胞信号转导通路）单体胰岛素形成二聚体单体胰岛素形成二聚体血液凝固血液凝固 血纤维蛋白聚合血纤维蛋白聚合抗原抗体间的识别抗原抗体间的识别烟草花叶病毒（烟草花叶病毒（TMV）的自我装配）的自我装配丙酮酸脱氢酶复合体丙酮酸脱氢酶复合体膜配体与受体的作用膜配体与受体的作用ligandreceptor酪氨酸激酶酪氨酸激酶3.2.2 蛋白质相互作用的研究方法nTagged Fusion Proteins (P

22、ull-down) 沉降实验nCo-immunoprecipitation (Co-IP) 免疫共沉淀nFluorescence Resonace Energy Trasfer (FRET) 荧光共振能量转移nBiacore (Surface Plasmon Resonance, SPR) 表面等离子共振 nYeast Two-hybrid (Y2H) 酵母双杂交荧光共振转移技术荧光共振转移技术表面等离子共振技术表面等离子共振技术噬菌体展示技术噬菌体展示技术酵母双杂交技术酵母双杂交技术基因外抑制子基因外抑制子合成致死筛选合成致死筛选分子生物学方法分子生物学方法免疫共沉淀免疫共沉淀Pull do

23、wn 试验试验遗传学方法遗传学方法蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用研究方法生物物理学方法生物物理学方法融合蛋白沉降实验 融合蛋白沉降实验基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化的蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化的配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase, GST）融合

24、标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。 一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一、鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二、鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用Pull-downGST pull-down, His pull-down免疫共沉淀 非变性裂解完整细胞时，胞内许多蛋白质间的结合状态可以保持下来。如果蛋白质X用其抗体

25、免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。 蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。 该技术在实际应用中常用融合表达的带有蛋白标签的特异性抗体与目标蛋白质或蛋白复合物结合，形成蛋白复合物沉淀。将蛋白质复合物溶解，再通过对蛋白标签具有特异吸附作用的亲和色谱柱将蛋白复合物分离纯化出来，进而通过凝胶电泳或质谱等技术鉴定分离的蛋白。 免疫共沉淀法常用来确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质。 该方法的优点是，所研究的相互作用蛋白均是经翻译后修饰的天然蛋白，可以表征生理条件下蛋白质间的相互作用。 但该方法需首先针对目标蛋白，制备出一定量的多克隆

26、或单克隆抗体，过程相对复杂。同时，目的蛋白质只有达到一定浓度才能与抗体结合形成沉淀，因而该法只适用于研究具有高表达量的目标蛋白，而且可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用，应用范围有较大局限。Co-Immunoprecipitation荧光共振能量转移( Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 荧光共振能量转移是近年来迅速发展的一种新技术，其最大的特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究，已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。 一对合适的荧光物质构成一个能量供受体对时，能量在它们之间可以发生转移。 194

27、8 年Frster提出的这一荧光共振能量转移理论奠定了FRET技术的理论基础。 1992 年，Prasher等首次从维多利亚水母中分离并克隆了一种荧光物质绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP) 。 随后，Heim等通过点突变等方式，得到了多种荧光光谱不同的荧光蛋白，如蓝色荧光蛋白( blue fluorescence protein, BFP) ，黄色荧光蛋白( yellow fluorescence protein, YFP) 和蓝绿色荧光蛋白( cyan fluorescence protein, CFP ) 等，提供了大量的能量供受体，为FRET技

28、术提供了现实基础。 目前FRET技术中常用的荧光蛋白对是YFP和CFP，当与荧光基团融合的被研究蛋白发相互作用时，荧光基团在空间上靠近，发生能量转移，通过检测供受体分子发射程度比率的变化就可得知蛋白质结合程度的强弱。 目前，FRET技术已在检测酶活性变化、膜蛋白的研究、信号转导、细胞周期调控等研究中发挥了重要作用。 1. 荧光信号的产生 荧光基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光。2. 什么是FRET? 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移

29、（FRET），实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。nThe donor emission spectrum must significantly overlap the excitation spectrum of the acceptor 供体发射波与受体激发波有重叠nThe donor and acceptor fluorophores must be in favorable mutual orientation 合适的空间取向nThe distance between the donor and acceptor fluorophores must be less than 10

30、0 距离100 FRET: basic requirements3. 绿色荧光蛋白 60年代，Shimomura等首先从水母（Aequoria Victoria ）中分离出一种水母发光蛋白（aequoren），该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母中提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP，后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。Osamu Shimomura Osamu Shimomura in the lab in the basement of his

31、 home. He is holding a sample of “real” GFP isolated from Aequorea victorea, not produced by bacteria. In order to do his research Shimomura estimates that he collected over a million Aequorea specimens。 （One Aequorea weigh about 50g）William Ward (right) met Douglas Prasher on a jellyfish-hunting ex

32、pedition in the 1980s Douglas Prasher was the first person to realize the potential of GFP as a tracer molecule.GFP could be used to report when a protein was being made in a cell.GFP could potentially be a very useful reporter molecule. 容易检测分子量小 不需要其它底物Douglas Prasher 1992 年克隆年克隆了了GFP基因基因Chalfie 将G

33、FP基因转入大肠杆菌中。Sergey A. Lukyanov 在珊瑚中发现了类似GFP的蛋白。他还发现了红色荧光蛋白。 Roger Tsien 对对GFP的机理作的机理作出了贡献。制造出了贡献。制造了很多了很多GFP突变突变体。体。2008年诺贝尔化学奖 人们在GFP基因的基础上已经制造出蓝色荧光蛋白，黄色荧光蛋白，青色荧光蛋白，又发现了红色荧光蛋白。其中蓝色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白之间可以发生荧光共振能量转移。GFP and other FPs (fluorescent proteins)Detecting methodsnMonitor changes in do

34、nor fluorescence 检测供体荧光nMonitor changes in acceptor fluorescence 检测受体荧光nSimultaneously measure changes in both donor and acceptor fluorescence using spectral imaging 同时检测受体和供体荧光表面等离子共振( Surface plasmon resonance, SPR) 表面等离子共振是数理科学与生物学相互渗透、结合而产生的一种全新的研究生物大分子之间相互作用的方法，近几年在生物技术领域得到了广泛的应用。 表面等离子共振( Surface plasmon resonance, SPR)是一种物理光学现象，当一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属膜上发生全反射时，若入射光的波向量与金属膜内表面电子的振荡频率相一致，光线即被耦合入金属膜引发电子共振，即表面等离子共振。由于共振的产生，导致反射光的强度在某一特定的角度大大减弱，反射光消失的角度称为共振角( SPR angle) ，共振角随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合物的分子质量成正比。