WBwesternblot试验常见问题解答文档

1、1 各位朋友：请教关于SDS-PAGE的问题。我的配胶体系如下：15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml 2.7ml30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67mlTris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml10%SDS 0.1ml 0.04ml10%APS 0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min。跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。谢谢！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶 SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 (毫

2、升) ： 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 ： 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0 30%Acr-Bis(29:1)： 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0 1M Tris, pH8.8： 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS ：0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵： 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED： 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 配制不同体积4%胶 SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 4浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水

3、 ： 3.16ml40Acr/Bic（37.5：1） ： 0.5ml0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） ： 1.26ml10SDS ： 50 微升m微升m10%AP（过硫酸胺） ： 25 TEMED ： 5 微升m加TEMED后，立即混匀即可灌胶。【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。【3】注意电泳液不要出问题（是否过期了，是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。2 pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？我转过很多次了，都没有看到过丽春红显色。但是有看到有人说能染上，是在是不知

4、道，请教给位大大了答：【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。【2】下面是丽春红的配方：10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。当然现在有很多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的说明书：1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2.用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春

5、红，进行后续的Western检测。 从使用说明中，我们可以看出，PVDF膜是可以用丽春红染色的。【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是530分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中洗一下，不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可以往下做了。【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的。【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有时候也不是很清楚。而且染

6、色后再往下做后面的结果会收到一定的影响。所以，如果熟练了，后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，如果染上了，说明其他的也会染上的。3 我做WB，曾跑出过条带，就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度，但后来就什么条带都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见预染的彩虹marker，但用丽春红染膜，却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人，就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？说说我的wb条件：蛋白大小：50kd5积层胶，10分离胶电泳先100v，后180v转膜条件：冰水中恒压100v 1

7、h 湿转（在转时电流在200400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜，滤纸两边个四层答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要用很多次，这很重要，我一般应用不超过两次。【2】转膜的时候，夹胶和膜的夹子的松紧要适中，可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧。【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用80伏20分钟，然后120伏。也可以一直用80伏。也可以先用60伏，然后80伏。【4】可以适当增加曝光时间试一下。4目的蛋白不表达。的leilaliu wrote:这是我的操作步骤：取0.1g 组织，加1ml裂解液（

8、1 mol/l tris.hcl 2.5ml ,NaCl 0.438g, TritonX-100 0.5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟，然后14000g 10分钟离心，取上清液。取20ug上样量，然后80V浓缩胶，130V分离胶，然后80V，180mA转膜2个小时，然后5%封闭一个小时，室温。然后一抗1：500（5%脱脂奶粉加TBST里面）孵育一个晚上，TBST清洗3次，每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗，孵育时间为1个小时，室温，TBST清洗3次，每次10分钟。再用ECL 处理等等。但是，我的目的蛋白：CaMK

9、IIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。答：【1】上样量一般是20100微克，你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来，为什么不加大上样量呢？可以加到100微克左右呀（这点其实挺重要的）。【2】你说：“80V，180mA转膜2个小时”。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧，怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的。【3】一抗孵育最好在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。【4】可以适当增加曝光时间。蛋白不的蛋【】【打飞人头儿就可突破5 各位好，我现在遇到的问题是，立春红显色后效果很好（师姐和实验老师都这

10、么认为），虽然不知道蛋白条带（45KD）的具体位置，但是比对Marker还是可以感觉到那部分的条带很清晰的。但是我始终做不出结果，现把步棸详解如下，希望大家帮我分析一下：1，封闭（5的脱脂奶粉）一小时，室温下摇床上进行。2，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），比例是1:1000(说明书上标示)。先室温摇床上1小时，再放在4度冰箱过夜。4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的最大标示）。室温摇床2小时。6，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。7

11、，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。8，曝光5分钟，显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）答：【1】细节决定成败！【2】你说你的显色液都是荧光了。我估计你每次做完了，显色用的器具都不洗吧？其实很多人都不在意，这点其实很重要的，就是凡是和膜接触的东西都要干净，要洗的很干净，当然夹膜用的镊子更是要干净。【3】整个显色曝光都应该在暗室里呀。你放外面显色干什么呀？这是一个连续的过程，没必要分开吧，感觉分开反而跟浪费时间呀。【4】具体问题具体分析。显色的时间不是固定的，如果膜放到显色液里，

12、荧光很强，迅速拿出，放到保鲜膜上，然后曝光就可以了。如果膜放到显色液里，荧光很弱，可以多放一会，其实不用放很长时间也是可以的。可以把膜放到保鲜膜上，因为保鲜膜上会粘有显色液的，在保鲜膜上照样可以进行显色反应的。如果膜很亮（就是说荧光很强），曝光时间可以很短的，如果荧光很弱或者看不到荧光，可以曝光很长时间的。如果荧光很强，我会曝光最短的时间，也就是说，把曝光盒（压片暗盒）盖上然后用最快的速度打开就可以了，如果荧光弱的话，我就用黑塑料袋把曝光盒装起来然后放入抽屉，去吃饭或者干其他事情，回来继续显影定影，条带照样很清楚的，哈，有时候那是相当的清楚。【5】我把你的步骤改了一下。供参考。1，封闭（5的脱

13、脂奶粉）4小时，室温下摇床上进行。（说明：封闭是很重要的一步，这步应该多话时间。一般来说，2小时也可以的，但是1小时有些短了）。2。此步删掉。3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），一抗用5的脱脂奶粉稀释，比例是1:1000(说明书上标示)。放在4度冰箱过夜。（一抗孵育不是时间越长越好，应该适度，如果越长越好，那直接在室温或者在37度放一夜不是更好。一抗用5的脱脂奶粉稀释效果远好于用TBST等稀释，这是我的亲身经历。封闭过后不用洗脱。）4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟，摇床上。（可以不用滤纸吸，直接放入二抗孵育）。5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的

14、最大标示）。室温摇床1小时（二抗1小时足够了）。6，TBS/T洗膜3次，每次10分钟。（可以不用滤纸吸）。7，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。8，曝光5分钟（曝光时间可以按实际情况的不同而不同），显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）6 本人在做一个18KD蛋白的wb，转膜后预染marker各个条带都可见，不知道就是目的条带都不能曝光出来。内参的B-actin条带清晰，背景也没有。想请教各位大侠：1.胞浆蛋白的提取是不是有什么特殊要求。有什么提取方法比较好！2.18kd蛋白的转

15、膜甲醇的浓度是不是要比较高。3.其他。希望能够有好的回答，最好能提供好的参考文献。谢谢！答：【1】你转膜后预染marker各个条带都可见，说明转膜没有问题。【2】感觉还是用试剂盒好一些。【3】可以适当减少电泳的时间。【4】测过蛋白浓度吗？蛋白浓度是多少呀？如果蛋白浓度不是很高，上样量不是很大的话，可以增加上样量，增加蛋白浓度。【5】增加一抗浓度，增加一抗孵育时间。【6】增加显色时间。【7】增加曝光时间，可以曝光很长时间的。【8】当然是0.2m的膜好一些，但是18KD的蛋白用0.45的膜也可以的。注意转膜时间不要太长。7请问有人做过19KD的蛋白吗？已经做了一段时间了，可是还是没有什么起色啊。现

16、在跑胶倒是已经可以了。但是转膜后染色看不到我要的条带啊。那条带在胶上就是很淡的，但是基本能看到。可是转膜后就真的什么都看不到了似的。有没有什么办法可以成功将量少的蛋白条带转膜啊（可以肯定的说我的转膜条件没有将我所需要的条带转过）。谢谢了。答：【1】没有问题，继续往下做就可以了。【2】很多人都在考马斯兰染色的胶上或者在丽春红染色的膜上找自己的目的条带，看到一个条带就说是自己的目的条带。其实真的是自己的目的条带的可能性很小。组织蛋白或者细胞蛋白中含有很多种蛋白的，所以碰巧是目的蛋白的可能性是很小的（尽管从预染MARKER知道分子量是相近的）。我们染胶或者染膜的目的并不是看自己的目的蛋白是否在胶上或

17、者是否转到了膜上。而是看胶上是否有蛋白，是否有比较清楚的蛋白条带。染膜就是看蛋白是否转到了膜上。通过整体的蛋白的情况来推测自己的目的蛋白的情况。并不是非要找出自己的目的蛋白。【3】要知道ECL的敏感性要比丽春红强很多的，也就是说比丽春红敏感很多倍的，染色染不出的蛋白，显色或者曝光照样可以出条带的。【4】你的膜上都看到了蛋白，说明整体上还是可以的，可以继续往下做。8. 我做的WB最近两次看到荧光，但压片子总是白片，并且荧光时间很短！我快疯了！请高手指点，谢谢！答：能看到荧光，当时很快就消失了，可能主要是荧光淬灭的问题。很多情况都会导致荧光淬灭，可能每个人的情况并不相同。如果胶片上没有条带，可以适

18、当延长曝光时间。【1】用保鲜膜包好的带荧光的膜，千万不要放到金属表面，碰到金属表面，荧光会迅速的淬灭。因为有些桌子是金属的，所以放到上面会导致荧光迅速淬灭。这是亲身经历的。有些战友提到用镊子碰到膜会导致荧光淬灭，可能是因为镊子是金属的缘故。【2】不注意的时候，把ECL的A和B混合了，以后再用，也会导致荧光淬灭。各溶液使用后，请盖紧瓶盖，以防失效。特别是B液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。【3】荧光可能对一些物质敏感，导致荧光淬灭。所以，尽量使和PVDF/NC膜接触的物品（例如保鲜膜、洗膜用的培养皿等）都是干净的。我以前都是用保鲜包裹膜，然后曝光，但是保鲜膜太薄，容易卷起来，我就用较厚的塑料

19、袋，但是发现荧光一接触塑料袋就迅速淬灭，我估计可能是因为后塑料袋上不干净，有些导致淬灭的物质。后来继续应用保鲜膜，就没有出现类似情况了。【4】夹膜用的镊子一定要干净，每次用它夹膜之前，一般可以先在液体里（比如应用中的TBST等液体）过一下（洗一下，就是在液体里摇一下），镊子不干净很容易导致荧光淬灭的。【5】荧光淬灭和蛋白抗体等也有原因。我以前就碰到过，我的是5个条带，发生淬灭的时候，有快有慢，不是5个条带一起淬灭。尽管后来都淬灭了。所以，估计和蛋白抗体等也有关系，但可能并不是主要的原因。9 现需要将28Ku与26Ku的两种蛋白通过跑SDS-PAGE区分出来。换句话说，我使用什么样的SDS-PA

20、GE条件能够使这两种蛋白的条带分开。比如用多大的胶浓度等.请精通此道的高手指点。谢谢！答：【1】哈，不好意思，我把“分开”的意思理解错了。我的理解中的“分开”是，可以用两张小膜同时转膜，然后28Ku与26Ku的两种蛋白分别转到这两张膜上。或者用一张膜转膜，然后能把这张膜剪开，两种分子两的膜分别到两张膜上。看来大家对“分开”的理解是两种蛋白能离开一定的距离就可以了。哈，这样是当然的，不过如果不能达到我上面说的那种情况，这所谓的“分开”对实验有什么意义吗？和分不开有什么区别吗？【2】哈，应该注意适度原则，“度”很重要，有些时候不是越大越好，要注意适度。其实二十几的分子量用10、12。15的胶都可以

21、的，把电压调到足够小，效果都可以的。根本就没有必要用18的胶的。下面是不同分子量蛋白的适用胶的选择。【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：（1）SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围 （KD)6%胶 50-150 8%胶 30-90 10%胶 20-80 12%胶 1040 （2）分离胶浓度（） 线性分离范围（KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212【2】浓缩胶一般都是选4或者5下面是5胶的配制方法：成分 - 配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 5%胶 2 3 4 6 8 10 蒸馏水 1.4 2.1 2.7 4.1 5.5 6.8 3

22、0%Acr-Bis(29:1) 0.33 0.5 0.67 1.0 1.3 1.7 1M Tris, pH8.8 0.25 0.38 0.5 0.75 1.0 1.25 10%SDS 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01【3】哈，目标要明确，如果目标错了，就不好了。你的目的到底是什么？是分开蛋白吗？我想最后的目标应该是曝光出条带吧。是吧？电泳时的蛋白什么样的分子量都有的，也有分子量之差小于1的，有什么影响吗？抗体和目标蛋

23、白结合，并不和与其相邻的蛋白结合，那么分开它有什么意义吗？曝光的时候曝不出来就可以了（只曝出目的蛋白）。【4】而想把两者曝光曝出来，用我上面帖子中的方法就可以了。10. 刚开始做western blot，走过两遍完整的过程，可是结果很奇怪，请各位老师指导分析。我的目的蛋白分子量 42kd ，抗体都是santa cruz的，一抗goat 抗 rat 多克隆，二抗驴抗羊-hrp, 蛋白marker是fermentas sm0671 可视的那种，ecl 发光剂 不知道牌子的和millipore都有用。分离胶是12的，照着分子克隆的我跑的两次，首先电泳时marker条带比正常的少，尤其似乎缺了我要看的

24、40kd左右的条带，而且条带很糊，越跑越谈。下面是膜上的marker条带，基本和胶上是对应的，浓度也差不多。和说明书上应该出来的条带差别很大，缺很多条带，胶上主要缺56kd和43kd的条带，请问这是怎么回事？小的那块膜是我第一次做，用的是师兄流下来的试剂，大的一张改用同学的试剂（除了30双丙和10sds），结果也还是一样。问题：1。marker缺条带，而且很糊，越跑越淡，请问可能有哪些影响因素？2。又或者是不是marker有问题？原来怀疑triscl PH的问题，测了一下，果然不大准，第二次就换了同学在用的，结果还是这样。ap 是现配的，temed 新买的，胶凝的很不错。30gel有几个月了，

25、一直放在4冰箱里，可能这个失效了？电泳缓冲液是买的10×的贮存液，基本是现配现用的。跑胶30ma恒流。marker是新买的，和同学一人一支，他跑8的胶，分子量100多的，跑的时候和我不一样，看不了条带。 答：【1】首先要注意电泳液的问题，是否过期？是否配错了？看左边的这张图，即使最下面还有条带，也会因为没有膜了，而显示不出来的。建议增加膜的长度。【2】对比两张图，发现如果把右边的图放大到和左边的一样大，那么我们就会发现其实两张图相差不多的。右边那张图的最下面一个条带已经很淡了，提示散开了，也就是说如果减少电泳时间的话，下面的条带很有可能出来的。【3】其实制作MARKER的公司也是欠考

26、虑的。如果红色条带下面的第4个条带也搞成红色的，那就好多了。【4】MARKER公司说明中的图，是用一定浓度的胶配制的。不同的浓度的胶会对MARKER产生影响的。即使同样浓度的胶，其他条件也很难完全相同，所以，MARKER和说明中有一定的区别是可以理解的。【5】注意如果胶配的不好，比如PH值，会对跑胶有影响的。【6】小分子量的MARKER，要早期观察，不要等胶跑了很久再观察。早期只要MARKER条带分开了，就可以数所有的MARKER条带，一般会找到的。【7】如果还不行，可以适当加大MARKER的上样量，这样跟容易找些。【8】可以适当减小跑胶的电压。11. 我的actin条带位置偏低,请问为什么?

27、答：【1】做RT-PCR的时候，给胶拍照的时候，做一定的调节，可以拍出红色的照片的。和上面的照片很象的。WB还真没见到过红色的图片，长见识了。【2】从第二张图我们看到了什么？左边的两个蛋白条带的位置要比其他的条带高一些，如果继续电泳的化，高的可能就明显了。从这里我们看到了什么？估计最可能的问题就是上样缓冲液出了问题。我先说一下上样缓冲液。【3】上样缓冲液中含有SDS。我说一下它的作用。SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 S

28、DS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。也就是说，如果上样缓冲液出了问题的话，决定蛋白泳动速度的就和蛋白的分子量和蛋白的带电价两者有关。这样就会出现条带位置不一的情况。所以，你的上样缓冲液可能有问题。有可能最后没有到1×，有可能没有混匀，有可能重新配制了，和以前的不一样了，可能上样缓冲液没有配制好，也可能有些蛋白的浓度过高而上样缓冲液中的SDS不够与其结合。就出现了楼

29、主所说的情况。【4】配胶的时候，有些液体的PH值没有调好12. 各位大侠,小弟是新手,最近在跑SDS-PAGE电泳,可是电泳的mark有时跑得出来有时候跑不出来(7条带0只跑出来3条或者4条),请各位指点一下,衷心感谢你答：你的分离胶是12的，你看一下你的MARKER上的说明，看它怎么说的，一般都MARKER都会给出一个胶的范围，说该MARKER适合什么样的胶。比如适合815的胶，有的MARKER 说该MARKER适合12的胶。往往适合胶范围大的MARKER的质量比较好。我买过两种MARKER，晶美的预染MARKER 就很好，条带很清楚。而买的北京天根公司的预染MARKER 就比较差，条带粗，

30、比较分散，小分子的很容易跑散掉。13. 那位高手给我点建议，我的转膜仪是六一的，我曾用恒流15mA过夜转，但结果重复性不好，不胜感激！答：【1】哈，我和大家的有些不同，我的转膜时间比大家要短。【2】我们学校以前的师兄师姐基本上是两个条件，一个是300毫安半小时，一个是380毫安半小时，用这两个条件，做的效果都挺好的。【3】现在我的一同学用300毫安半小时转膜，分子量分别为27和32KD，效果挺好的。我们用的都是0.45的PVDF膜。和我一起做的现在用的是380毫安25分钟（曾经用过380毫安30分钟，效果也挺好的），我们的分子量分别为42，46，47，105KD。效果都挺好的。大家看到这里，估

31、计很多人都会说我在乱说，105KD的，你用25分钟就转好了，让人怀疑。其实我也怀疑，但这是事实。我开始是把膜剪开的，分子量46的用380毫安25分钟，105KD的用380毫安45分钟，效果都挺好，但是分开转有些麻烦。有一次我搞错了，把两张膜一起转了，后来也没办法了，就硬着头皮接着往下做了，结果曝光的条带也是很好的。从这以后，我就都用380毫安25分钟。从这可以看出，转膜的条件限制的不是很严格的，有很大的浮动度。就拿我的105KD蛋白来说，380毫安转25分钟和45分钟都可以。同时我们也会看到很多人的转膜条件相差的挺远的，但是效果还是都可以的。【4】估计不同的装置，不同的膜，不同的电泳液都会对转

32、膜有影响的。【5】我的电泳液一般只有2次，不用第三次。我转膜时的降温措施还是比较到位的，里面有冰槽，外面加冰袋。【6】我对膜的处理也是比较严格的。我是先用甲醇泡沫1分钟，然后把膜放入转移液中2小时左右（我只是说我是这么做的，不是说非要这么做。有些人没这么做，曝光的条带也挺好的）。【7】我用的是迷你3的转移装置。【8】综上所述，转膜一般有较大的浮动范围的，限制不是很严格的。一般电流小，时间就要多一些的；电流大，时间就少一些。我不提倡转膜过夜的，感觉这就是简单问题复杂化，25分钟就能解决的问题，干嘛非要浪费一晚上14. 我做WB快3个月了,内参能做出来,暗室下能看到很明显的荧光条带,但是目标蛋白一

33、直没从出现过影子,该怎么办?我的目标蛋白54KD,内参是actin,做的是组织内源性蛋白.考染胶可看到较多的条带,很细较弱,转膜后丽春红染膜,整条泳道一片红,但是条带很少,只有几条,内参条带很明显,目标条带若隐若现.下面说说我的实验步骤,请大家帮忙分析分析,谢谢!1.组织蛋白提取用的是碧云天试剂盒,蛋白浓度一般是2ug/uL左右,上样量30ug/孔.我用的是Bio-rad电泳仪,每孔只能上样20uL.2.转膜15V,35min,Bio-rad半干转3.5%脱脂牛奶封闭RT,1h;一抗1:1000或1:500RT 2h或4度过夜(倒扣法);二抗1:200RT 1-1.5h;TBST洗膜,10mi

34、n*3次4.ECL发光液(碧云天),内参和荧光标签都能做出来.问题:1.是不是我的组织没有我的目标蛋白?是否有其他办法能简单的检测我提取的总蛋白中含有我的目标蛋白,除外点杂交(我做过,暗室里面点蛋白的位置一团荧光很快就没有了,怀疑是假阳性)?2.考染样品蛋白中条带也很少,很细,但是内参很明显,是否提蛋白也有问题?我的目标蛋白主要在核内表达,是否很难提到呢?本来想上传图片的,压缩后图片还是很大了,传不了.没办法大家帮帮忙吧,快疯掉了!答：【1】一般核内蛋白都用核蛋白提取试剂盒。 【2】不知道你裂解的时候是否加了蛋白酶抑制剂，可以加PMSF的。下面是PMSF 的配制方法。1.74mg/ml (10

35、mmol/L)PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，20保存。用的时候把它加入到裂解液中，使其变为1mmol/L的PMSF。【3】你的蛋白浓度一般是2ug/uL左右。我做过肝、肾、肺、肠等组织，肠的蛋白浓度低一些，但一般也会在10微升/微克左右。你的是组织蛋白，一般不会这么低的，应该比你的蛋白浓度要高。找一下原因，有可能是降解了。如果没有降解，可以适当减少裂解液的用量，这样就可以增加蛋白浓度了。【4】我看了你的电泳图和丽春红染色膜的图了。尽管不是很清楚，但是ECL 的灵敏性要比丽春红高出很多，两者不在一个数量级上，如果做的好，你的膜是足可以曝光出条带

36、的。【5】上面的方法用过后，如果还不出条带。可以考虑增加一抗的浓度，一抗用5的脱脂奶粉配制。延长一抗的孵育时间。15. 各位大侠：我做的western 背景特别高，几乎就是整个膜的显影，请大家帮我分析一下原因吧，下面是*作步骤：蛋白分子量178kd，80v半个小时，120v3个小时，转膜4个小时，室温摇床封闭1个小时，一抗分别取1：2000，1：4000，1：8000，4度冰箱里过夜，TBST洗3次，每次10分钟，二抗1：20001个小时，TBST洗3次，每次10分钟，请各位快指导指导?答：【1】最可能的原因就是封闭的不够。建议延长封闭时间，我是5脱脂奶粉室温摇床上封闭4小时，奶粉一定要溶好，

37、要完全溶解，没有沉淀。你的一小时似乎有些短了。【2】适当降低二抗的浓度。不知道你的二抗的建议稀释比例是多少？我有一个二抗的建议稀释比例是1：2000100000。如果你的建议稀释比例也是这么大，那么就大胆的降低二抗的浓度。【3】TBST 洗涤时用的器具要干净。这一点也挺重要的。【4】如果上样量过大，蛋白浓度过大会产生上述现象的。减少上样量或者降低蛋白浓度，这也是挺重要的一步。不知道你的上样量和蛋白浓度时多少。一般上样量在20100微克左右比较好。【5】适当减少放在ECL中的时间。16. 我做Tricine-sds-page,蛋白经TCA浓缩，配方和浓缩方法见附件；电泳图最左边是小分子量mark

38、,大小分别是20100Da、14400Da、7823Da、5856Da、3313Da五条带，其余孔均为浓缩后的样品，跑到离分离胶底部约0.5cm时停止电泳。但mark还是只跑出三条带是怎么回事，而且每次下面都有粗粗的带，是溴酚兰吗?请大家给分析下，到底怎样才能跑出完整的marker带？ 答：【1】注意看电泳液是不是有问题：配错了？过期了？MARKER一般都对胶都有一定的要求，也就是说它一般只适用一定范围的胶，不是所有的胶都适合的。所以，你看一下你的MARKER上的说明，你的16胶是不是在它的范围内。【2】MARKER条带很容易受到溴酚蓝的影响，小分子量的更容易受到影响的。你可以这样试一下：和M

39、ARKER 相邻的两个泳道不要上样，这样与其相邻的孔里的溴酚蓝就不会弥散过去，不会影响道MARKER，MARKER的所有条带就容易出来了。【3】如果分子量很小的话，可以不用跑的那么久，一般跑到胶的1/32/3就可以了。17. 我做的片子看起来是白片子，仔细看的话（对着光放白纸上）还是有目的条带的，用的抗体都是说明书上的初始浓度，封闭是脱脂奶粉、室温摇床一小时，一抗度过夜，二抗室温摇床一小时，大虾帮分析一下原因，谢谢！答：【1】增加蛋白浓度或者上样量。测一下蛋白浓度是多少，算一下上样量是多少。如果这两者低的话，增加两者就可以了。如果你的目的蛋白表达低的话，也可以增加上样量。有没有用内参，内参的条

40、带怎么样？如果内参条带也很弱的话，那就很可能是上样量的问题，增加上样量一般就可以了。另外还可以适当增加一抗的浓度。你说你用的是初始浓度，是不是说明中所给出的最大浓度呀？可以用到最大浓度，如果通过增加上样量等方法还不行的话，可以适当增加一抗浓度，必要的时候可以比说明中建议的最大浓度还大，当然要考虑一抗够不够用的问题。【2】增加一抗的孵育时间。可以先摇床室温1小时，然后再4度摇床过夜。一抗用5脱脂奶粉稀释，这样一般会好一些的。【3】封闭结束后，可以不洗膜，直接放入一抗中孵育。【4】一抗孵育后的洗膜，有有利的一面，也有不利的一面。你可以洗三次，每次5分钟。这样可能对你的结果有好处。【5】增加2抗浓度

41、和二抗的孵育时间。【6】增加在ECL中的时间。【7】增加曝光时间。【8】增加在显影液中的时间。18. 问题1：组织中提蛋白和细胞提蛋白有没有什么区别？我提组织蛋白是先用裂解液做成10%的匀浆，然后放冰上裂解30分钟，再4度离心12，000×30min，取上清，置-20度冰箱中保存。回答：本质上是一样的。离心的时间有些长了。一般12000转/分钟，离心510分钟就可以了。提组织蛋白的时候，在冰上放一段时间就可以再研磨一会，然后再放到冰上，过一会再研磨（在冰上操作），裂解的时间一般是30分钟。期间可以加用超声组织。提细胞蛋白和提组织的区别就是细胞要从培养瓶/板中先提取出来。一般用细胞刮子

42、或者消化液的方法提取细胞。问题2：蛋白定量:我们采用的是 Bradford蛋白浓度测定方法，没有用试剂盒，就是自己配的7个浓度的BSA溶液：0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5(ug/)，然后在96孔板中每个浓度加20ul，再加入200ul的G-250染色试剂，最后用酶标仪测浓度，做出的标准曲线R平方大概只有0.98多，还不够标准。请问各位战友，这种测浓度是不是标准曲线R平方要达到0.999才准呀？怎么样才能测得准？回答：R的平方达到0.999，难度太大了，我是肯定达不到。我的方法和你的有些不同。我不做标准曲线，直接测蛋白浓度。我也是用的酶标仪。我把空白对照、标准、待测

43、蛋白同时加入96孔板中，在酶标仪的CURVE这一项中，设置曲线，然后读结果，就可以直接测出待测蛋白的蛋白浓度，当然标准曲线同时可以测出。一般标准曲线的R大于等于0.995我就满意了，认为是可以的。当然如果你的要求高，当然更好了。怎样才能测的准，首先移液枪一定要准，还有就是手法呀一致，而且加样品的时候最好快一些，如果太慢，第一孔和最后一孔的时间间隔如果太长的话，就可能会影响结果。问题3：最后显影时发现胶片上的条带都是连在一起的，重复几次还是这样的结果，真是急死了，都不知道是什么原因造成的，请各位战友帮帮忙呀! 回答：（1）上样量太大，或者蛋白浓度过高。（2）一抗的浓度过高。（3）在ECL中放的时

44、间偏长，可以减少放在ECL中的时间。（4）曝光时间过长，减少曝光时间。19.western blot 整个膜上都是荧光，特异条带没有，怎么回事？答？【1】最可能的原因就是封闭的不够。建议延长封闭时间，我是5脱脂奶粉室温摇床上封闭4小时，奶粉一定要溶好，要完全溶解，没有沉淀。【2】适当增加一抗浓度，延长一抗孵育时间。我一抗一般4度过夜。一抗最好用5的脱脂奶粉稀释。【3】减少二抗孵育的时间，一般室温1小时就可以了。37度的话，一般30分钟就可以了。适当降低二抗的浓度。【4】TBST 洗涤时用的器具要干净。这一点也挺重要的。【5】如果上样量过大，蛋白浓度过大会产生上述现象的。减少上样量或者降低蛋白浓

45、度，这也是挺重要的一步。不知道你的上样量和蛋白浓度时多少。一般上样量在20100微克左右比较好。【6】转膜应该没问题吧？膜上能保证有蛋白条带吧？可以用丽春红染色看膜上的蛋白情况怎么样的。如果膜上的情况也是一片红色那就在转膜及转膜前找问题。如果膜上的蛋白很清楚就在转膜后找原因。20. 各位大虾，我用辣根过氧化酶标记的二抗，一、二抗等这些步骤完成以后，用碧云天的ECL显色，然后显影，定影。出来的结果是可以看到泳道，但是不能出来目的蛋白的条带！不知道原因，请大虾们帮忙解释！答：【1】如果抗体没有问题的话，应该离成功不远了。【2】增加封闭时间。我是用5脱脂奶粉摇床上室温封闭4小时，效果挺好的。【3】不

46、知道你的一抗的推荐稀释比例是多少。可以适当的增加一抗的浓度。延长一抗的孵育时间。我是4度摇床一抗孵育过夜的。一抗可以用5 的脱脂奶粉稀释。【4】既然你的胶片上出现了泳道但没有蛋白条带，可以适当减少洗涤的时间。转膜过后，把膜放到甲醇里1分钟，然后用TBST摇床上室温洗涤一次5分钟就可以了封闭了。封闭结束后可以直接加入一抗。一抗孵育过后，可以用TBST摇床上室温洗三次，每次5分钟。二抗孵育后，可以用TBST摇床上室温洗涤三次，每次10分钟。不要过长、次数过多。【5】转膜过后，所有接触到膜的器具都要保持清洁。21. 有几个问题请教：制胶时，拔出梳子后，发现上样空周围的胶总是低于玻璃上沿，上样量一直受

47、到影响。尝试过，在灌浓缩胶时，让其溢出玻璃边缘后，再插梳子，但是没有用。电泳时，明明看到样本已经压成一条直线，结果，进入分离胶不久，又弥散看来。这是胶的配方有问题？还是电泳液有问题？希望各位多多指教！答：1】经常看到说浓缩胶会收缩的帖子，估计这和梳子的插法有一定的关系。首先浓缩胶一定要灌满，越满越好，一定要高出薄玻璃板，也就是说在保证叫浓缩胶不流下来的情况下，加的浓缩胶越多越好。梳子一定要插到底。梳子上面有卡槽的，也就是梳子插到一定程度卡槽会和薄玻璃板接触，再插就插不下去了，正确的插法就是插到这个位置（就是说要插到底）。这样胶的效果很好，用肉眼是看不出浓缩胶收缩的。【2】拔梳子的时候，可以把胶

48、放到电泳液里之后再拔，也就是说在电泳液里拔梳子。这样的效果会好一点的。【3】还有就是如“zhangqw1978”战友所说的，可以适度的多加一点AP(过硫酸铵)和TEMED。这样胶凝固的快一点，不容易收缩。【4】还有你说，进入分离胶后会弥散开来的。不知道你说说的弥散是什么意思。上样的蛋白如果能看到的，应该是溴分兰吧，正常的话，它也会有一定的弥散的。你可以考马斯兰染色看一下蛋白条带的情况。可能你的蛋白条带是好的呢22. 我要检测的目的蛋白表达低，上样50UG后考染也只有很细微的条带显示。如果这样转膜后应该会更少。所以我想请教大家有没有什么好的方法提高蛋白量呢。浓缩和变成冻干粉的方法除外。比如说大家在60mm皿中（细胞铺满）最少都要加多少裂解液就能裂解完全。我是加了80ul，还能比这更少不。答：【1】当