海拉细胞与自噬PPT学习教案

1、会计学1海拉细胞与自噬海拉细胞与自噬壹壹背景知识背景知识贰贰实验目的实验目的叁叁实验过程实验过程肆肆实验结实验结果果伍伍实验讨实验讨论论第1页/共17页壹壹背景知识背景知识是一种人工培养，具有无限增殖能力的细胞。 海拉细胞海拉细胞1951年由盖伊等从人子宫颈癌组织分离出来的株细胞。HeLa是原患者假名海伦莱恩的缩写。 第2页/共17页可以连续传代可以连续传代；细胞株不会衰老致死，细胞株不会衰老致死， 并可以无限分裂下去并可以无限分裂下去；跟其他癌细胞相比，增跟其他癌细胞相比，增 殖异常迅速殖异常迅速； 感染性极强。感染性极强。特点特点第3页/共17页动物细胞培养动物细胞培养如何进行细胞培养?培

2、养时又需要提供哪些必要条件呢？ 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。增殖。概念概念第4页/共17页过程过程胚胎或幼龄动物的组织器官胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬液细胞悬液10代细胞代细胞50代细胞代细胞剪碎胰蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用胰蛋白酶分散用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞细胞，说明细胞间的物质主要是间的物质主要是蛋白质。动物细蛋白质。动物细胞培养适宜的胞培养适宜的PH为，此环境下胃为，此环境下胃蛋白酶（）没有蛋白酶（）没有活性，而胰蛋白活性，

3、而胰蛋白酶酶(7.2-8.4)的活的活性较高。性较高。比老比老龄动物龄动物的组织细胞的组织细胞增殖能力强增殖能力强，有丝有丝分裂分裂旺盛旺盛。 分化分化程度程度越越低低，增殖能力越增殖能力越强，越强，越容易容易培养。培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖细胞增殖缓慢，核缓慢，核型可能变型可能变化化动物组织细胞间隙中含有一定动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。和韧性的组织和器官。贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型代以内，保持正常二倍

4、体核型传代培养第5页/共17页贰贰实验目的实验目的研究缺乏血清和氨基酸的培养研究缺乏血清和氨基酸的培养基中的海拉细胞与自噬的关系基中的海拉细胞与自噬的关系。第6页/共17页叁叁实验过程实验过程实验材料实验材料：培养基（10%胎牛血清，的小苏打，缓冲液，100单位毫升的青霉素100mg/ml的链霉素）；实验仪器：实验仪器：塑料Falcon玻璃管（25平方厘米和75平方厘米） 第7页/共17页实验步骤实验步骤：细胞培养细胞培养细胞制备细胞制备细胞包埋细胞包埋细胞固定细胞固定光镜定位和超薄切片光镜定位和超薄切片第8页/共17页 保持细胞的生长对数期，一直进行五次传代培养，每次当细胞贴壁时快速更换培养

5、基，得到大量的海拉细胞。细胞制备细胞制备细胞培养细胞培养实验组：用缺乏氨基酸，血清的培养基润洗玻璃管两次，然后每60分钟，抽出培养基，立即用新鲜的培养基替换。对照组：培养基中包含10%胎牛血清以及所有必需氨基酸的组分，在最后三次被以相同方式固定的传代培养后不再用新鲜培养基润洗、喂养。第9页/共17页细胞固定细胞固定实验组：在缺陷培养基中培养1,3,6,12,以及24个小时之后，多层单层培养在室温下塑料瓶中被固定为30分钟 。对照组：巴比妥乙酸盐缓冲液中在pH4.7梯度乙醇溶液中脱水前用0.5醋酸双氧铀染色细胞的固定单层细胞。 细胞包埋细胞包埋在三次环氧丙烷洗涤之后，细胞将会被环氧树脂812浸透

6、，经过分离，被放置到填充有环氧树脂（杜邦）的BEEM胶囊里去。 光镜定位和超薄切片光镜定位和超薄切片已分离的细胞层聚合块进行单层细胞原位超薄切片，用醋酸铀和柠檬酸铅染色，观察酸性磷酸酶反应的产物。 第10页/共17页伍伍实验讨实验讨论论在缺乏血清和氨基酸培养的海拉细胞中，观察到自噬液泡的数量在以惊人的速度增加。这个细胞自噬模型可以用来进一步研究控制自噬的机制：海拉细胞显然能够通过消化自己的细胞质来应对营养剥夺。 一种观点：第11页/共17页另一种观点：实验组和对照组中，自噬泡以相同的速度形成，但由于实验组中缺乏氨基酸和血清，导致次级溶酶体中的酸性水解酶活性降低。故自噬溶酶体内的内源性物质被溶酶体的酶消化分解的速度减慢，自噬小泡将持续更长时间，所以造成了一种自噬小泡增多的假象。存在假说：海拉细胞的自噬可以提供氨基酸来合成必需的酶和ATP的底物。因此，这个自噬将代表着一种细胞生存机制。 第12页/共17页细胞凋亡：细胞凋亡：是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。 核染色质的存在是区分细胞凋亡和自噬作用最有益的标准; 第13页/共17页异噬：异噬：细胞外物质（如作为营养成分的大分子颗粒物质、细菌、病毒等）经吞噬作用或吞饮作用进入细胞，形成吞噬体或吞