amy土壤整理(采样、测定,微生物)

1、目录一、土壤样品采集方法3二、土壤样品处理和保存4三、土壤物理性质项目的测定61.土壤水分的测定：铝盒烘干法62.土壤温度的测定：热敏电阻法、地温计法63.土壤容重的测定：环刀法64.土壤田间持水量的测定：环刀法75.水稳定团粒的测定：湿筛法7四、土壤化学性质项目的测定81.土壤pH值的测定：电位计法82.土壤有机质含量的测定：马弗炉灼烧法83土壤氮含量的测定（硝态氮、氨态氮、全氮）83.1硝态氮的测定83.2氨态氮的测定93.3 全氮测定（采用凯氏定氮法）104、土壤磷的测定（全磷、有效磷）114.1 全磷：HClO4H2SO4法112.2土壤速效磷含量的测定：0.5mol·L-1

2、NaHCO3浸提钼锑抗比色法145土壤钾的测定（速效钾、全钾）155.1.土壤速效钾含量的测定：醋酸铵浸提火焰光度计法155.2全钾：NaOH熔融，火焰光度法（FP640型火焰光度计）166、土壤酶活性的测定181蔗糖酶活性的测定182蛋白酶活性的测定193碱性磷酸酶活性的测定204脱氢酶活性的测定215FDA水解酶活性的测定22四、土壤微生物231分离与纯化232菌株的鉴定的生理生化实验252.1糖类发酵与氧化实验252.2过氧化酶测定262.3 细胞色素氧化酶测定263微生物鉴定274. 土壤微生物生物量的测定29一、土壤样品采集方法土壤样品的采集方法对分析结果和评价至关重要。因此，采集的

3、样品必须具有代表性。由于土壤自然条件、类型和污染状况不同，采样的方法也不同，常用的方法有：1、对角线采样法。这种方法适宜于受到废水污染或污水灌溉的田块。由田块进水口向对角引一条斜线，将此线分成三等份或五等份，在每等份的中央点取样。2、蛇形采样法。这种方法适宜于面积较大，地形不平坦，土壤不均匀的田块。采样品按蛇形多布置一些。3、棋盘形采样法。对于面积适中、地势平坦，地形完整的田块，适合用这种采样法。如土壤不均匀，布置10个以上的采样点土壤均匀，采样点可少些。4、梅花形采样法。对于面积不大，地势平坦，土壤较均匀的田块，适合用这种方法。梅花形采样的布点以510个为宜。方法名称适用田块采样点数梅花形采

4、样法适宜面积较小、土势平坦、土壤较均匀的田块510个棋盘式采样法中等面积、地势平坦、地形完整、但土壤较不均匀的田块10个以上蛇形采样法面积较大、地势不太平坦，土壤肥力不够均匀20个以上注意事项：1、采样深度，对一般土地采样深度1530cm即可。对根深的作物可取至50cm的深度。2、采样时间，可在作物的收获季节采集土壤样品随时采样分析。3、采样量，12kg土量。4、每个采样点的取土深度及重量应均匀一致，土样上层和下层的比例也要相同。采样铲或筒形取样器应垂直于地面，入土至规定的深度；斜插或入土角度不同，有可能使各样点的取土深度不够一致。二、土壤样品处理和保存1、样品登记编号：根据试验情况标记土样。

5、2、鲜样保存：测定土壤水分、亚铁、铵态氮、硝态氮等项目时，需用新鲜土样。为了能真实地反映土壤在田间自然状态下的某些理化性状，新鲜样品要及时送到化验室处理，先用粗玻璃棒或塑料棒将样品弄碎混匀，然后迅速称样进行分析测定。新鲜样品一般不宜贮存，如需暂时贮存时，可将新鲜样品装入塑料袋，扎紧袋口，放在冰箱冷藏室或进行速冻处理。3、湿样晾干：在晾干室将湿样放置晾样盘（白瓷盘）中，摊成2厘米厚的薄层自然阴干，并间断地用木棰敲碎、翻拌、拣出碎石，砂砾及植物残体等杂质。4、一个样品准备四个装样瓶(或样品袋)，把装样瓶洗净晾干，填好样品标签并贴好。5、样品缩分：将晾干敲碎的样品反复混合均匀，然后铺成一圆形，过圆心

6、画十字线将圆分为四等分，取对角线二份(另二份弃去)，照此方法继续缩分，最终留500克左右制样。6、样品粗磨：将风干样于白色搪瓷盘中用木棰、木棒再次压碎样品，全部过20目尼龙筛。过筛后的样品全部置于有机玻璃板上混匀。7、样品细磨：取粗磨样品100克，用磨样机或研钵磨至全部过60目尼龙筛；再取粗磨样品100克，用磨样机或研钵磨至全部过100目尼龙筛。8、样品分装：将过20目、60目和100目样品分别装入相应的样品瓶中(各100克)，作为检测样品，剩余的约200克过20目筛样品装入另一个样品瓶中，作为自备库存样备用。过20目筛(孔径0.9毫米)粗磨样可直接用于土壤pH、土壤代换量、土壤速测养分含量、

7、元素有效性含量分析；过60目筛(孔径 0.25毫米)样品用于农药或土壤有机质、土壤全氮等分析；过100目(孔径0.149毫米)土样，用于土壤重金属和元素全量分析。制样注意事项：1、晾样时不得将样品铺放在报纸等不洁净的纸张上；样品不得在阳光下直接暴晒；因时间关系需烘干样品时，需在45以下温度烘烤；不得在晾样前缩分样品；制样中，采样时的土壤样品标签与土壤样品始终放在一起，严禁混错；每个样品经风干、磨碎、分装后送到实验室的整个过程中，使用的工具与盛样容器的编号必须始终一致，以免搞错；制样所用工具每制备一份样品后擦洗一次，严防交叉污染。2、在一个采样单元中，如果用多个样点的样品分别进行分析，其平均值或

8、其他统计值（如标准差或置信区间等）的可靠性，无疑要比单独取一个样品的分析结果更大，但这样做的工作量比较大。如果把多个样点的土样等量地混合均匀，组成一个“混合样品”进行测定，工作量就可大为减少，而其测定值也可得到相近的代表性，因为混合样品的测定值，实际上相当于各个样品分别测定的平均值。如果采样点较多而使混合土样太多时，可以把全部土样放在盘子或塑料布上，用手捏碎混匀，用四分法淘汰。四分法的方法是：将采集的土壤样品弄碎，混合均匀，铺成四方形，划分成如“田“字形的四份（见下图），保留对角的两份（1，4）土样，混合后留作样品，而把另外两份（2，3）弃去。如果一次分取后仍嫌土样太多，可再次四分，直到样重1

9、kg左右为止。采集水稻土或湖沼等烂泥土样时，四分法往往难以应用，可改为在塑料盆（或桶）中用塑料棒将各样点烂泥搅匀后，再取出所需数量的土样。注明采样地点、日期、采样深度、土壤名称、编号等。同时做好采样记录。三、土壤物理性质项目的测定1.土壤水分的测定：铝盒烘干法取编有号码的小铝盒，烘干后，冷却，在分析天平上称其恒重（W1），取风干土样5g左右，放入已知重量的铝盒（W1）中，在分析天平上准确称重（W2），去盖放在烘箱中（105110）烘8h。直至恒重。烘干后打开烘箱，取出，加盖后放在干燥器内冷却至室温后，称重（W3），再放入烘箱中烘3-5h，冷却后称重，以验证是否恒重。土壤吸湿水%=2.土壤温度的

10、测定：热敏电阻法、地温计法3.土壤容重的测定：环刀法选具有代表性的地段，先在采土处用铁铲铲平。将环刀托放在已知质量的环刀（精确至0.01g）上，环刀内壁稍擦上凡士林，将环刀刃口向下垂直压入土中，直至环刀筒中充满土样为止。通常表层土壤需采5个重复样品，下层土壤需按层次每层采3个重复样品。用削土刀切开环周围的土样，取出已充满土的环刀，用削土刀细心削平环刀两端多余的土，并擦净环刀外面的土，立即加盖以免水分蒸发。 将盛有土样的环刀除去顶盖，然后放入烘箱中，在105±2下烘干4h，再在干燥器中冷却后称至恒量（精确至0.01g）。 式中： B土壤容量，g/cm3； m1环刀的质量，g； m2环刀

11、+烘干土质量，g； V环刀容积，cm3 。4.土壤田间持水量的测定：环刀法在田间选择挖掘的土壤位置，用土刀修正土壤表面，按要求深度将环刀向下垂直压入土中，直至环刀筒中充满土样为止，然后用土刀切开环刀周围的土样，取出已充满土的环刀，细心削平环刀两端多余的土，并擦净环刀外围的土，将环刀及筒内的土壤无损地带回实验室内。在环刀底端放大小合适的滤纸2张，用纱布将环刀和土样包好，用橡皮筋扎好。放在玻璃皿中，玻璃皿中事先放23层滤纸，将装土环刀放在滤纸上，用胶头滴管不断地滴水于滤纸上，使滤纸经常保持湿润状态，至水分沿毛管上升而环刀内土柱全部充满水，达到恒重为止。取出装土环刀，去掉纱布和滤纸，取出一部分土壤放

12、入已知重量的铝盒内称重，并放入105110烘箱中，烘至恒重，再取出称重。5.水稳定团粒的测定：湿筛法取滤纸一张，用铅笔划上适度大小的方格50格，放在用铁纱网上，然后放于培养皿中，另划同样方格纸一张作记录用。取直径23mm的团粒50粒两份依次放在已装置好的滤纸上的每一方格中。用滴管加水，将滤纸边缘浸湿，使滤纸和铁纱网紧贴在一起。然后用滴管沿皿壁慢慢加水使团粒在3min内为水所饱和，直到水将团粒浸没。团粒一经浸没就开始记下时间，以后每隔1min记录一次被破坏的团粒数目，一直进行到第11min才停止观察。计算经过一定时间（11min）以后，仍未散开的团粒数目，即为团粒的水稳度。同样的测定重复一次。团

13、粒结构水稳度（）×100四、土壤化学性质项目的测定1.土壤pH值的测定：电位计法称取10克风干土样，各放在50 ml的烧杯中，加入25 ml水，间歇摇动，放置30分钟后用酸度计测定。2.土壤有机质含量的测定：马弗炉灼烧法采用马弗炉 (九楼公共实验室) 灼烧法，在300 温度下，用沉积物样品的重量损失来估算有机物含量。 计算公式为：有机质%（样品中的减少量/样品重）×1003土壤氮含量的测定（硝态氮、氨态氮、全氮）3.1硝态氮的测定试剂：（1）硫酸钙（CaSO4·2H2O）、碳酸钙（CaCO3）、氢氧化钙（Ca(OH)2）、碳酸镁（MgCO3）、硫酸银（Ag2SO4

14、）、1:1 NH4OH、活性碳。（2）酚二磺酸试剂：称取白色苯酚（C6H5OH）25.0g置于500ml三角瓶中，加浓H2SO4225ml，沸水加热6h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。（3）10µg/ml NO3-N标准溶液：准确称取KNO30.7221g溶于水，定容1L，此为100µg/ml NO3-N溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg/ml NO3-N标准溶液。实验方法（1）浸提：称取土样25 g放在250 ml三角瓶中，加入CaSO4·2H2O 0.25 g和125 ml水，盖塞后，用摇床震荡10 min。然后在三角瓶中加入适量活性炭，

15、放置5 min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液收集到干燥洁净的三角瓶中。（2）测定：吸取清液50 ml于100 ml小烧杯中，加CaCO3 0.05 g，在水浴上蒸干。到达干燥时迅速冷却，冷却后加入酚二磺酸试剂2 ml，并旋转烧杯使试剂接触到所有的蒸干物。静置10 min使其充分作用后，加水20 ml，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1:1 NH4OH并不断搅混匀，至溶液呈微碱性（溶液显黄色）再多加2 ml，以保证NH4OH试剂过量。然后将溶液全部转入100 ml容量瓶中，加水定容。用分光光度计在420 nm波长处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。（3）标准曲线的

16、绘制：分别取10 µg/mlNO3-N标准液0、1、2、5、10、15、20 ml于小烧杯中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成标准曲线。硝态氮含量的计算采用下列公式：土壤中NO3-N含量（mg/kg）=(NO3-N) ×V ×ts /m式中：(NO3-N)从标准曲线上查得的显色液NO3-N质量浓度（µg/ml）； V显色液的体积（ml）； ts分取倍数； m烘干样品质量（g）。3.2氨态氮的测定试剂：（1）2 mol/L KCl溶液：称取149.1 g氯化钾（KCl）溶于水中，稀释至1 L。（2）苯酚溶液：称取苯酚（C6H5OH）1

17、0 g和硝基铁氰化钠Na2Fe(CN)5NO2H2O 100 mg稀释至1 L。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4 冰箱中保存。（3）次氯酸钠碱性溶液：称取氢氧化钠（NaOH）10 g、磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）7.06 g、磷酸钠（Na3PO4·12H2O）31.8 g和 52.5 g/L次氯酸钠(NaOCl，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10 ml溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4 冰箱中保存。（4）掩蔽剂：将400 g·L-1的酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）与100 g/L的EDTA二钠盐溶液等体积混合。每100 ml混

18、合液中加入10 mol/L氢氧化钠0.5 ml。（5）2.5 µg/ml铵态氮（NH4+N）标准溶液：称取干燥的硫酸铵(NH4)2SO4，分析纯0.4717 g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1 L，制备成含铵态氮（N）100 µg/ml 的贮存溶液；使用前将其加水稀释40倍，即配制成含铵态氮（N）2.5 µg/ml的标准溶液。实验方法：（1）浸提：称取20 g土样，置于250 ml三角瓶中，加入氯化钾溶液100 ml，塞紧塞子，在摇床上震荡1 h。取出静置，待土壤氯化钾悬浊液澄清后，吸取一定量上层清液进行分析。（2）比色：吸取土壤浸出液5 ml放入50 ml容量瓶中

19、，加入5 ml氯化钾溶液，然后加入苯酚溶液5 ml和次氯酸钠碱性溶液5 ml，摇匀。在20左右的室温下放置1 h后，加掩蔽剂1 ml以溶解可能产生的沉淀物，然后用水定容至刻度。用分光光度计，在625 nm波长处进行比色，读取吸光度。（3）标准曲线的绘制：分别吸取0、2、4、6、8、10 ml NH4+N标准液于50 ml容量瓶中，各加10 ml氯化钠溶液，同（2）步骤进行比色测定。铵态氮含量的计算采用下列公式：土壤中NH4+（N）含量（mg/kg）=×V× ts /m式中：显色液铵态氮的质量浓度(µg/ml)； V显色液的体积(ml)； ts分取倍数； m样品质量

20、（g）。3.3 全氮测定（采用凯氏定氮法）试剂：（1）盐酸（HCl）：0.05 mol/L标准液，用碳酸氢钠法标定盐酸。（2）氢氧化钠（NaOH）：40%的水溶液（m/v）。（3）硼酸（H3BO3）：2%的水溶液（m/v）。（4）混合指示剂：甲基红（G5Hl5N3O2）溶于乙醇配成0.1%乙醇溶液；溴甲酚绿溶于乙醇配成0.5%乙醇溶液。两种溶液等体积混合，即为混合指示剂。（5）加速剂：硫酸铜（CuSO4 ·5H2O）和硫酸钾（K2SO4）按1：15比例在研钵中研磨，仔细混匀过40目筛。（6）98%浓硫酸（H2SO4）实验方法：（1）消化操作：准确称取1g土样放入消化管中，然后加入5g

21、加速剂，10 ml浓硫酸。将其放到电热炉上消化40 min，其间温度为420，保持消化管内液体连续沸腾，沸酸在瓶颈部冷却回流。消化结束后，冷却至室温。（2）蒸馏：冷却后，直接将消煮管放入KDN型定氮仪中蒸馏，在冷凝管末端放上已经加入15 ml接收液（硼酸和混合指示剂）的250 ml锥形瓶，使蒸馏导出管的末端浸入接收液内。直至氨气全部蒸出后，即接收液体积为150 ml时停止蒸馏。（3）滴定：吸收氨后的接收液，用标定后的盐酸溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰紫色为终点。（4）空白测定：不加样品，按上述步骤做同样的操作。全氮含量的计算采用下列公式：土壤全氮（N）量（mg·kg-1）=（V2-

22、V1）×C×0.0140/m×106式中：V2滴定式样时消耗酸标准溶液的体积（ml）； V1滴定空白时消耗酸标准溶液的体积（ml）； C酸标准溶液的mol/L浓度； m试样重量（g）； 0.0140氮的毫克当量数。4、土壤磷的测定（全磷、有效磷）4.1 全磷：HClO4H2SO4法主要仪器721型分光光度计；LNK-872型红外消化炉。试剂（1）浓硫酸（H2SO4，1.84 g·cm-3，分析纯）。（2）高氯酸CO（HClO4）70%72%，分析纯。（3）2，6-二硝基酚或2，4-二硝基酚指示剂溶液。溶解二硝基酚0.25g于100mL水中。此指示剂的变色

23、点约为pH3，酸性时无色，碱性时呈黄色。（4）4mol·L-1氢氧化钠溶液，。溶解NaOH16g于100mL水中。（5）2mol·L-1（1/2H2SO4）溶液，吸取浓硫酸6mL，缓缓加入80mL水中，边加边搅动，冷却后加水至100mL。（6）钼锑抗试剂。A.5 g·L-1酒石酸氧锑钾溶液：取酒石酸氧锑钾K(SbO)C4H4O60.5g，溶解于100mL水中。B.钼酸铵硫酸溶液：称取钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O10g，溶于450mL水中，缓慢地加入153mL浓H2SO4，边加边搅。再将上述A溶液加入到B溶液中，最后加水至1L。充分摇匀，贮于棕

24、色瓶中，此为钼锑混合液。临用前（当天），称取左旋抗坏血酸（C6H8O5，化学纯）1.5g，溶于100mL钼锑混合液中，混匀，此即钼锑抗试剂。有效期24小时，如藏冰箱中则有效期较长。此试剂中H2SO4为5.5mol·L-1（H+），钼酸铵为10 g·L-1，酒石酸氧锑钾为0.5 g·L-1，抗坏血酸为1.5 g·L-1。（7）磷标准溶液。准确称取在105烘箱中烘干的KH2PO4（分析纯）0.2195g，溶解在400mL水中，加浓H2SO45mL（加H2SO4防长霉菌，可使溶液长期保存），转入1L容量瓶中，加水至刻度。此溶液为50g·m L-1P标

25、准溶液。 吸取上述磷标准溶液25mL，即为5 ug·m L-1P标准溶液（此溶液不宜久存）。实验方法：（1）待测液的制备：准确称取通过100目筛子的风干土样0.50001.0000g(土壤1g) ，置于50mL开氏瓶（或100mL消化管）中，以少量水湿润后，加浓H2SO48mL，摇匀后，再加70%72%HClO410滴，摇匀，瓶口上加一个小漏斗，置于电沪上加热消煮（至溶液开始转白后继续消煮）20min。全部消煮时间为4060min。在样品分解的同时做一个空白试验，即所用试剂同上，但不加土样，同样消煮得空白消煮液。将冷却后的消煮液倒入100mL容量瓶中（容量瓶中事先盛水3040mL），

26、用水冲洗开氏瓶（用水应根据少量多次的原则），轻轻摇动容量瓶，待完全冷却后，加水定容。静置过夜，次日小心地吸取上层澄清液进行磷的测定；或者用干的定量滤纸过滤，将滤液接收在100mL干燥的三角瓶中待测定。（2）测定：吸取澄清液或滤液5mL（对含P，0.56g·kg-1以下的样品可吸取10mL），以含磷（P）在2030g为最好注入50mL容量瓶中，用水冲稀至30mL，加二硝基酚指示剂2滴，滴加4mol·L-1 NaOH溶液直至溶液变为黄色，再加2mol·L-1（1/2H2SO4）溶液1滴，使溶液的黄色刚刚褪去（这里不用NH4OH调节酸度，因消煮液酸浓度赠大，需要较多碱去

27、中和，而NH4OH浓度如超过10g·L-1就会使钼蓝色迅速消退）。然后加钼锑抗试剂5mL，再加水定容50mL，摇匀。30min后，用880nm或700nm波长进行比色（注2），以空白液的透光率为100（或吸光度为0），读出测定液的透光度或吸收值。（3）标准曲线：准确吸取5g·m L-1，P标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL。分别放入50mL容量瓶中，加水至约30mL，再加空白试验定容后的消煮液5mL，调节溶液pH为3，然后加钼锑抗试剂5mL，最后用水定容至50mL。30min后开始进行比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g&

28、#183;m L-1P。从标准曲线上查得待测液的磷含量后，可按下式进行计算：土壤全磷（P）量（g·kg-1）=式中：待测液中磷的质量浓度（g·kg-1）； V样品制备溶液的mL数； m烘干土质量（g）； V1吸取滤液mL数； V2显色的溶液体积（mL）； 10-3将g数换算成的g·kg-1乘数。注：（1）最后显色溶液中含磷量在2030g为最好。控制磷的浓度主要通过称取量或最后显色时吸取待测液的毫升数。（2）本法钼蓝显色液比色时用880nm波长比700nm更灵敏，一般分光光度计为721型，只能选700nm波长。2.2土壤速效磷含量的测定：0.5mol·L-

29、1NaHCO3浸提钼锑抗比色法试剂 （1）碳酸氢钠浸提剂：0.5mol/L，称取42.0g碳酸氢钠，加水溶解并稀释至近1000mL，如溶液pH不在8.5，则用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，再加水稀释至1000mL。 （2）硫酸溶液：1mol/L，量取56.0mL硫酸（ 1.84g/mL），缓慢加入水中，再加水稀释至1000 mL。 （3）氢氧化钠溶液：2mol/L，称取80.0g氢氧化钠溶于水，再加水稀释至1000mL。 （4） 对硝基酚指示剂：称取0.20g对硝基酚，溶于100mL水中。 （5）无磷活性炭。 （6）钼锑贮存液：量取153mL硫酸（ 1.84g/mL），缓慢地加入4

30、00mL水中，搅拌，冷却。另取10g钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O溶解于约60的300mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓慢倒入钼酸铵溶液中，再加入100mL 5g/L酒石酸锑钾（KSbOC4H4O6·21H2O）溶液，最后用水稀释至1000mL，避光贮存。 （7）钼锑抗显色剂：称取1.50g抗坏血酸（C6H8O6），溶于100mL钼锑贮存液中，随用随配。 （8）磷标准溶液：称取在105烘2h的磷酸二氢钾（KH2PO4）0.4394g(精确至0.0001g)溶于水中，加5mL硫酸（1.84g/mL），再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100g磷。吸取10.00m

31、L上述标准溶液置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，此溶液1mL含5g磷，不宜久存。 仪器 分光光度计。 振荡机实验方法 （1）待测液的制备：称取通过2mm筛孔的风干土样5.0000g(精确至0.0001g)置于200mL锥形瓶中，加入100mL碳酸氢钠浸提剂，加塞，放在振荡机上振荡30min(室温25±1)。用慢速滤纸过滤于200mL容量瓶中，用水洗涤，再加水稀释至刻度，摇匀。如滤液有颜色，可加少量无磷活性炭作脱色处理。同时做空白试验。 （2）测量吸光度：吸取5.00mL20.00mL溶液置于50mL容量瓶中，加水至20mL，加1滴对硝基酚指示剂，用1mol/L硫酸溶液调节

32、溶液至微黄色（中和有强烈气泡发生，要一滴一滴边加边摇，勿使气泡逸出瓶口），待气泡不再发生后，加入5mL钼锑抗显色剂，加水稀释至刻度，摇匀。放置30min后，在分光光度计上，于700nm波长处，用1cm2cm吸收皿测定吸光度，从工作曲线上查得相应的磷量。 （3）工作曲线：分别取0、5、10、15、20、25、30g磷标准溶液置于50mL容量瓶中，按5.2操作步骤操作，绘制工作曲线。结果计算 WP有效磷量，g/kg； C从工作曲线上查得有效磷量，g； t分取倍数（溶液总体积50mL/吸取溶液体积）； m风干土样质量，g； K风干土样换算成烘干土样的水分换算系数。 5土壤钾的测定（速效钾、全钾）5.

33、1.土壤速效钾含量的测定：醋酸铵浸提火焰光度计法试剂 （1）乙酸铵浸提剂：1mol/L，称取77.1g乙酸铵溶于近1000mL水中，如pH不是7，则用氢氧化铵（1+1）或乙酸（1+1）调节至pH7.0，再加水稀释至1000mL。 （2）钾标准溶液：称取在105烘2h的0.1907g氯化钾（KCl），精确至0.0001g，溶于1mol/L乙酸铵浸提剂中，并用1mol/L乙酸铵浸提剂稀释至1000mL，此溶液1mL含100g K。 仪器 原子吸收分光光度计（发射部分）或火焰光度计。 振荡机。 实验方法（1）待测液的制备：称取通过2mm筛孔的风干土样5.0000g(精确至0.0001g)置于200m

34、L锥形瓶中，加入50mL乙酸铵浸提剂，加塞，立即放在振荡机上振荡30min。用慢速滤纸过滤于100mL容量瓶中，用乙酸铵浸提剂洗涤，再以乙酸铵浸提剂稀释至刻度，摇匀。同时做空白试验。 （2）测定发射强度：在选定工作条件的原子吸收分光光度计（发射部分）或火焰光度计上，于766.5nm波长处（火焰光度计用钾滤光片）测定发射强度，从工作曲线上查得相应的钾量。 （3）工作曲线：分别取0、200、500、1000、2000、4000g钾标准溶液置于100mL容量瓶中，用乙酸铵浸提剂稀释至刻度，摇匀，在相同条件下测定发射强度，绘制工作曲线。结果计算 按下式计算土壤速效钾量：式中：WK速效钾量，mg/kg；

35、 C从工作曲线上查得速效钾量，g； m风干土样质量，g； K风干土样换算成烘干土样的水分换算系数。5.2全钾：NaOH熔融，火焰光度法（FP640型火焰光度计）试剂 （1）氢氧化钠。 （2）盐酸溶液，1+1。 （3）硫酸溶液：4.5mol/L，量取250mL硫酸（ 1.84g/mL），缓慢加入750mL水中，再加水至1000mL。 （4） 钾标准溶液：称取在105烘2h的0.1907g氯化钾（KCl），精确至0.0001g，溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100g K。仪器 原子吸收分光光度计（发射部分）或火焰光度计。 银坩埚。 实验方法（1）待测液的制备：称取通过0.149

36、mm筛孔的风干土样0.2000g(精确至0.0001g)置于银坩埚中，加入2g固体氢氧化钠。将银坩埚放入高温炉内，由室温升至300，保温10min；再升高温度至750，保温15min，取出冷却。在银坩埚中加入10mL水，微热使熔块溶解，然后将溶液移入50mL容量瓶中，用热水和2mL 4.5mol/L硫酸溶液多次洗涤银坩埚并倒入容量瓶内，溶液体积控制约40mL。加入5滴盐酸（1+1）溶液和5mL 4.5mol/L硫酸溶液，摇动后冷却至室温，再加水稀释至刻度，摇匀后静置澄清或用慢速滤纸过滤，溶液作测钾用。同时做空白试验。 （2）测定发射强度：吸取5.00mL10.00mL溶液置于50mL容量瓶中，

37、加水稀释至刻度，摇匀。直接在选定工作条件的原子吸收分光光度计（发射部分）或火焰光度计上，于766.5nm波长处（火焰光度计用钾滤光片）测定发射强度，从工作曲线上查得相应的钾量。 （3） 工作曲线：分别取0、250、500、1000、2000、3000g钾标准溶液置于50mL容量瓶中，加入与待测液中等量的氢氧化钠和硫酸量（如吸取5.00mL待测液，应加入0.2g氢氧化钠和0.7mL 4.5mol/L硫酸溶液），再加水稀释至刻度，摇匀，在相同工作条件下测定发射强度，绘制工作曲线。 结果计算 按下式计算土壤全钾量：式中： WK=全钾量，g/kg； C从工作曲线上查得全钾量，g； t分取倍数（溶液总体

38、积50mL/吸取溶液体积mL）； m风干土样质量，g； K风干土样换算成烘干土样的水分换算系数。6、土壤酶活性的测定1蔗糖酶活性的测定试剂（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5 g 3,5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 N氢氧化钠和50 ml 水中，再加30 g酒石酸钾钠，用水稀释至100 ml。（2）pH 5.5 磷酸缓冲液：1/15 M 磷酸氢二钠（11.867 g Na2HPO4·2H2O溶于1 L蒸馏水中）0.5 ml加1/15 M磷酸二氢钾（9.078 g KH2PO4 溶于1 L蒸馏水中）9.5 ml即成。（3）8 %蔗糖溶液。（4）甲苯。（5）葡萄糖标准液：将葡萄

39、糖先在50-58 条件下，真空干燥至恒重。然后取500 mg溶于100 ml苯甲酸饱和溶液中（5mg还原糖/ml）即成标准葡萄糖溶液。再用标准液制成1ml含0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg葡萄糖的工作溶液。实验方法（1）操作步骤：称5 g风干土，置于50 ml三角瓶中，注入15 ml 8 %蔗糖溶液，5 ml pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37 下培养24 h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1ml，注入50 ml容量瓶中，加3 ml 3,5-二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5 min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3 min。最后用蒸馏水稀释至

40、50 ml，并在分光光度计上于波长508 nm处进行比色。（2）标准曲线绘制：取1 ml不同浓度的葡萄糖工作液，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。计算公式：蔗糖酶活性以24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克数表示。葡萄糖（mg/g）=c×50×ts/m式中：c标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 50显色液体积，ml；ts分取倍数； m土壤质量，g。2蛋白酶活性的测定试剂（1）1 %白明胶溶液（用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制）；（2）甲苯；（3）磷酸盐缓冲液（pH 7.4）；（4）0.1 N H2SO4；（5）

41、20 Na2SO4；（6）2茚三酮溶液：将2 g茚三酮溶于100 ml丙酮，然后将95 ml该溶液与1 ml CH3COOH和4 ml水混合制成工作液（该工作液不稳定，只能在使用前配制）；（7）甘氨酸标准液：浓度为1 ml含100 g甘氨酸的水溶液：0.1 g甘氨酸溶解于1 L蒸馏水中。再将该标液稀释10倍得10 g甘氨酸/ml溶液的甘氨酸工作液。实验方法（1）操作步骤：取2 g风干土样置于50 ml容量瓶中，加入10 ml1%用pH 7.4磷酸盐缓冲溶液配制的白明胶溶液和0.5 ml甲苯；在30 恒温箱中培养24 h；培养结束后，将瓶中内溶物过滤；取2 ml滤液置于试管中，加入0.5 ml

42、0.1 N硫酸和3 ml 20%硫酸钠以沉淀蛋白质，然后滤入50 ml容量瓶，并加入1 ml 2%茚三酮溶液；将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10 min；将获得的着色溶液用蒸馏水稀释定容至刻度线；最后在560 nm处进行比色。（2）标准曲线绘制：分别吸取0、1、3、5、7、9、11 ml甘氨酸工作液于50 ml容量瓶中即获得甘氨酸浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 ug/ml的标准溶液梯度，然后加入1 ml 2%茚三酮溶液。冲洗瓶颈后将混合物仔细摇荡，并在煮沸的水浴中加热10 min。将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至刻度。在560 nm处进行比色，最后绘制标准曲

43、线。计算公式：土壤蛋白酶的活性，以24 h后1 g土壤中甘氨酸的微克数表示。甘氨酸（ug/g）= c×50×ts/m式中：c标准曲线上查得的甘氨酸浓度，ug/ml； 50显色液体积，ml； ts分取倍数； m土壤质量，g。3碱性磷酸酶活性的测定试剂（1）1 mg/ml对硝基苯磷酸二钠（用缓冲液配制）；（2）pH 9.4硼酸盐缓冲液；（3）0.5 mol/L CaCl2；（4）0.5 mol/L NaOH；（5）甲苯；（6）对硝基苯酚标准液：取1 g对硝基苯酚溶于水，稀释至1 L（1 mg/ml）取1 ml标准液转入100 ml容量瓶中，稀释至刻度，仔细混匀。实验方法（1）操

44、作步骤：取鲜土0.5 g，加0.2 ml甲苯浸提土壤中的磷酸酶，再加5 ml含对硝基苯磷酸二钠1 mg/ml的反应底物溶液（缓冲液），放入30 培养箱中培养1 h，然后用4 ml 0.5 mol/L NaOH终止酶反应，再加1 ml 0.5 mol/ L CaCl2充分混匀，用滤纸过滤。滤液在410 nm处比色。（2）标准曲线的绘制：分别取1、2、3、4、5 ml溶液（相当于10、20、30、40、50 ug的对硝基苯酚）置于瓶中，用水稀释至5 ml，加1 ml 0.5 mol/L CaCl2和4 ml 0.5 mol/L NaOH，在410 nm比色绘制标准曲线。计算公式：磷酸酶活性，以24

45、 h后1 g土壤中释放处的酚的毫克数表示。酚（mg/g）=c×10×ts/1000m式中：c标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 10显色液体积，ml； ts分取倍数； 1000毫克和微克换算系数； m土壤质量，g。4脱氢酶活性的测定试剂（1）pH 7.6 Tris-HCL缓冲液的配制：A：0.2 M三-（羟甲基）-氨基甲烷溶液（1000 ml含24.23克）B：0.2 M HCl100 ml A+76.8 ml B，加水稀释至400 ml，准确调节pH为7.6（2）1% TTC-Tris缓冲液：1 g TTC+100 ml Tris-HCL缓冲液（3）1%葡萄糖：1 g葡

46、萄糖+100 ml蒸馏水（4）将2和3混合均匀，即成（0.5 %TTC+0.5%葡萄糖）-Tris缓冲溶液（pH 7.6）（5）TTC标准液：准确称取0.4%TTC溶液0.8ml放入10ml具塞试管中，加少许连二亚硫酸钠粉末，摇匀后即产生红色的TTCH(TPF)，再用甲醇定容至刻度，摇匀。此时溶液浓度为TTCH 320 ug/ml。实验方法（1）操作步骤：称取4克鲜土于50 ml三角瓶中，加入4 ml（0.5 % TTC+0.5%葡萄糖）-Tris缓冲溶液（pH 7.6），置37 暗室培养24小时。取出后用少量甲醇提取后过滤，再用50 ml容量瓶定容。滤液马上在485 nm波长下比色。（2）T

47、TC标准曲线绘制：TTC标准液中吸取0.25 ml、0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml置于10 ml具塞试管中，用甲醇定容至刻度，得到8、16、32、48、64 ug/ml的TTCH溶液。以甲醇作为空白，480 nm波长下比色，绘制标曲。计算公式：脱氢酶活性，以24 h后1 g土壤中释放出的TTCH的微克数表示TTCH（g/g）=c×50×ts/m式中：c标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 50显色液体积，ml； ts分取倍数； m土壤质量，g。5FDA水解酶活性的测定试剂（1）pH 7.6，60 mmol/L磷酸缓冲液；（2）4.9 mmol/L F

48、DA底物溶液：20 mg FDA底物溶于10 ml丙酮；（3）丙酮；（4）FDA标准液：称取0.2 g荧光素溶于100 ml无菌的60 mmol/L，pH 7.6磷酸缓冲液中，即为2 mg/ml的母液，然后再取出1 ml定容至10毫升，即为0.2 mg/ml的标准液。实验方法（1）操作步骤：取1 g风干土样放入125 ml三角瓶中，加入50 ml，pH 7.6，60 mmol/L的磷酸缓冲液和0.5 ml 4.9 mmol/L的FDA底物溶液，封住三角瓶口，摇动几秒，使反应混合物均匀，后在37 下培养3 h，培养结束后，每瓶立即加入2 ml丙酮，混合均匀以终止FDA水解反应。取30 ml土壤悬

49、浮液，放入50 ml离心管，在8000 g下离心5 min，将滤液转入比色管，在490 nm 波长下比色。（2）标准曲线的绘制：分别吸取0、0.15、0.5、1.5和2.5 ml的荧光素的标准液，转入50 ml容量瓶，加入一定量的pH 7.6，60mmol/L的磷酸缓冲液，后加入2.5 ml的丙酮，最后定容至50 ml，摇匀后在490 nm波长下比色，绘制标曲。计算公式：FDA 水解酶活性活性，以每小时1 g土壤中释放出的FDA的微克数表示FDA(g/g)= c×50×ts×1000/（m×t）式中：c标准曲线上查得的酚浓度，mg/ml； 50体积，ml

50、； ts分取倍数； m土壤质量，g； t培养时间。四、土壤微生物多样性的实验研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上包括以下几类：(1)传统的微生物平板纯培养方法；(2) Biolog微平板分析方法；(3)脂肪酸分析方法；(4)分子生物学方法；(5)其他方法，如用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法(Fumigation-incubation )、底物诱导呼吸法(Substrate-induced respiration)和光合微生物色素法等等：用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法；用于测定土壤酶活性分析方法；用于土壤微生物形态鉴定的方法；用于测定微生物能量代谢的分析方法；用于测定

51、微生物对土壤养分利用与转化功能的同位素示踪法；以及以荧光为基础的显微技术，包括荧光标记蛋白、荧光染色和荧光原位杂交等。1分离与纯化1、准备将内装90ml的蒸馏水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培养基、涂布棒、试管（内装9ml蒸馏水）若干、平皿若干放入高压锅高温灭菌。配制肉汤蛋白胨固体培养基平板（1）牛肉膏5g；（2）蛋白胨10g；（3）NaCl 5g；（4）琼脂20g；（5）自来水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121来菌20min。无菌生理盐水（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20个左右的玻璃珠）； （2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl

52、 （作10倍稀释用）。2、稀释称取土样1.0g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-2）。用1mL的无菌吸头从中吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的试管中，吹吸3次，振荡混匀（10-3）。然后再用同一支1mL吸头，从此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL无菌水的试管中（10-4），依此类推制成10-5，10-6，10-7各种稀释度的土壤溶液。3、涂布平板将10-5、10-6、10-7的稀释样品分别涂布到已制好的固体培养基平板上，每种涂3个平板。4、培养用一支1mL无菌吸头分别从稀释度10-7、10-6和10-5的土壤稀释液中各吸取0.1mL对号放入已写好稀释度的肉汤蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。涂布时从低浓度到高浓度分别在培养基表面轻轻地涂布，可转动皿底一定角度，继续涂布，直至均匀。每个浓度做3个平板。将平板置于37。C恒温培养三天。5、分离从平板中挑取单个菌落进行平板划线分离培养，培养2天，共选了4种菌。6、纯化将划线长出的菌接种于已准备好的固体斜面培养基中。培养2天。7、镜检对平板中的4种菌分别进行美蓝染色、革兰氏染色、芽孢染色，放在显微镜下观察，并记录结果。8、保种将长出菌的