具核梭杆菌通过调控miR

1、具核梭杆菌通过调控 miR-181b 在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制研究背景 : 具核梭杆菌 (Fusobacteriumnucleatum,Fn) 是口腔常见致病菌 , 但 近年来研究发现，该菌与结直肠癌的发生发展密切相关。Fn是一种具有侵袭性， 黏附性的厌氧菌 ,同时它也具有促炎性因子释放以及调节肿瘤免疫微环境的能力。Fn如何通过炎性因子致结直肠癌的发生发展，当中机制尚不明确。研究表明, 当肠上皮细胞受到Fn感染时,炎性因子表达增高,但尚无相关文献从miRNA的角 度研究由此引起的炎性因子表达上调的相关机制。目的：通过构建Fn感染Caco-2细胞的炎症模型,运用miRNA测序技术分析由

2、 此所引起miRNAs基因表达差异；通过生物信息学的方法筛选出表达差异显著的 miRNA及其下游靶基因，并对其调控靶基因的机制及引起的生物学效应进行研究，从而初步探索得到 Fn 感染在促炎症信号通路上相关结直肠癌发生发展的作用机 制。方法:1.构建了 Fn感染Caco-2细胞的炎症模型,运用miRNAW序技术分析由 此所引起miRNAs表达差异;2.通过qPCR ELISA、WesternBlot等方法对模型中 TNF-a在转录水平及蛋白水平上的变化进行检测;3.使用Tran swell实验分析Fn 与 Caco-2 细胞共培养后诱导产生的趋化因子及其引起的生物学效应 ;4. 采用 qPC肪法

3、验证模型中表达差异显著的 miR-181b的表达情况;5.通过转染的手段, 分别上调及下调 Caco-2 细胞中 miR-181b, 再加入 Fn 感染处理 , 由此研究在 Fn 介 导下miR-181b与TNF-a之间的相关关系;6.采用生物信息学工具及双荧光素酶 检测方法证实miR-181b与TNF-a的靶标关系。结果:1.miRNA测序结果分析显示，Fn感染Caco-2细胞引起的相关差异miRNA有653个,其中在处理组中低表达 645个,高表达8个,其中,miR-181b表达 显著降低 (p=0.001345), 主要涉及炎症、增殖、细胞凋亡等多个信号通路的变化2.构建Fn感染Caco

4、-2细胞模型作为处理组(M0l=200:1,共培养6h),采用qPCR ELISA、WesternBlot检测TNF-a在mRN及蛋白水平上的表达变化,结果显示Fn 感染后无论在转录水平还是蛋白水平，处理组中TNF-a的表达均比对照组显著 升高 , 证明建模成功。3.收集Fn与Caco-2细胞共培养6小时后的培养液上清作为趋化因子,采用 Transwell 的方法, 观察其对淋巴细胞的趋化作用 , 发现淋巴细胞穿膜数量明显 增多(p=0.0445)。4.采用qPCF对miRNA测序结果进行验证,结果显示处理组中 miR-181b表达稳定下调，与测序结果相符(p=0.0078)。5.采用转染的手

5、段，转入miR-181binhibitor, 通过qPCR ELISA、WesternBlot等方法检测TNF-a表达的变化,发现miR-181b受到抑制后,TNF- a 的表达上调；另一方面,将Caco-2细胞中miR-181b过表达后,加入Fn感染处理， 发现TNF-a仍然表达下调。6.采用targetscan等miRNA靶基因预测网站找到 miR-181b-5p与TNF-a 3'UTR的结合位点,以双荧光素酶检测(luciferaseAssay) qPCR ELISA、WesternBlot 等方法，并证实 miR-181b 与 TNF-a 靶标关系。7.取Fn与miR-181b过表达的Caco-2细胞共培养的上清液,通过Tran swell 细胞趋化实验观察培养上清对人淋巴细胞的招募作用 , 发现 miR-181bmimics 组 淋巴细胞穿膜数量降低(p<0.0001)。结论:1.Fn感染Caco-2