Cd2+对中肋骨条藻的毒性效应

1、Cd2+寸中肋骨条藻的毒性效应1.1试验材料中肋骨条藻由淮海工学院海洋学院实验室提供。cdcl2 2.5h2o 为 分析纯，购自上海振欣试剂厂。用无菌水配制cdcl2 母液（156mmol/l），备用。试验海水取自江苏省连云港连岛海区（海水中的 cd2+浓度为 0.152 卩 g/l ）,黑暗沉淀 7 d 后用 0.45 卩 m 的滤膜过 滤，煮沸消毒，冷却后用来配制培养液。1.2试验设计微藻培养液选用 f/2 营养盐配方5，略有改进。为减少配方中各 元素对重金属的影响，不添加原配方中的edta 和微量元素；为维持 ph 值相对稳定，另加缓冲剂 1 g/l nahco3 、10 mg/l 尿素

2、。培 养条件：光照度 3 0003 500 lx，光源为日光灯，光暗比为 12 h :12 h, ph 为（8.3 士 0.2 ）,盐度为（3.02 士 0.05 ） % 温度为（21.0士 0.5 ）C,于指数生长期接种，均为一次性培养，中间不加营养盐。用于培养微藻的三角烧瓶先在稀盐酸中浸泡数日，再分别用相应浓度的 cd2+培养液预平衡 48 h，以消除试验过程中容器壁的吸 附作用，培养时每天充分摇瓶 35 次，并随机交换位置以减少光 照可能引起的误差。根据预试验培养结果，设置 100、200、400、800 和 1 600 卩 g/l 5 个cd2+浓度组，另设 1 个对照组（0 卩 g/

3、l ）,每组 3 个平行。在暴 露时间试验中，以 72 h 半效应浓度（ec50）的近似值作为试验浓1.3.5抗坏血酸过氧化物酶（apx）活性的测定抗坏血酸过氧度，分别于暴露后 3、6、12、24、48、96 h 测定超氧化物歧化酶（sod）活性，试验重复 1 次。1.3生物效应指标测定1.3.1细胞密度和相对增长率（k）测定 细胞密度测定用卢戈氏 液固定，采用血球计数板直接计数法在显微镜下进行计数，每个样 品计数 3次，取平均值。相对增长率计算方法参见文献6，用直 线内插法7求得 72 h ec50 值。1.3.2类胡萝卜素（car）含量测定 类胡萝卜素含量的测定参照 文献8，90 泅酮提取

4、后，用日本岛津 uv-1600 型紫外可见分光光 度计测定。1.3.3谷胱甘肽（gsh）含量测定 谷胱甘肽含量的测定参照文献9，以 dtnb 显色，在 412 nm 下检测。1.3.4 sod 活性测定 粗酶液制备：取待测藻液 20 ml，于 5 000 r/min下离心 10 min，去上清液，沉淀中加入适量 0.05 mol/l 磷 酸缓冲液（ph7.0 ），超声波破碎藻细胞；破碎液于 4C6 500 r/min 下离心 20 min，上清液即为粗酶液。 sod 活性测定采用 beauchamp 等 10 建立、 bewley11改进的氮蓝四唑（nbt ）光化学还原反应 法。反应结束后，利

5、用日本岛津 uv-1600 型紫外可见分光光度计在 560 nm 处测定吸光度，测定时用 0.1 ml 磷酸缓冲液代替粗酶液测 得对照组吸光度。1 个酶活力单位（u）定义为能引起反应初速度（不 加酶时）半抑制时的酶用量。化物酶活性的测定参照文献12的方法进行，以 1 min 氧化 1 卩 mol抗坏血酸（asa）的酶量为 1 个抗坏血酸过氧化物酶活力单位（u）。136丙二醛（mda 含量的测定 mda 含量采用硫代巴比妥酸法13，14进行定量测定：取适量粗酶液加入到含有 0.5%硫代巴比 妥酸（tba ）的 20%三氯乙酸溶液中，混合后于 100C下水浴 30 min, 迅速冷却，4 000

6、r/min 离心 10 min，上清液分别于 532 nm、600 nm 处测定吸光度。藻细胞 mda 含量的单位为卩 mol/个，按文献15的 方法计算。1.4数据统计分析数据处理采用 spss 11.0 统计分析软件，并进行 t 检验和差异显著性分析，用 excel 2003 绘图。2 结果与分析2.1 cd2+胁迫对中肋骨条藻生长的影响由图 1 可见，cd2+胁迫下各处理组的中肋骨条藻生长均表现出明显 的抑制作用，且随着 cd2+浓度增大微藻细胞密度的增长趋于缓慢，1 600 卩 g/l cd2+处理组细胞密度 48 h 时比 24 h 时上升了 5.4%,72 h 时比 48 h 时下降了 4.1%，表明中肋骨条藻在高浓度 cd2+的胁 迫下出现了死亡。由图 2 可见，cd2+胁迫下各处理组中肋骨条藻的相对增长率随着cd2+浓度的增大迅速降低，72 h 时 800 卩 g/l cd2+