黄酮的提取方案

1、黄酮提取实验方案1材料与仪器1.1材料1.2试剂芦丁，无水乙醇，氢氧化钠，石油酰，硝酸铝，三氯化铁，三氯化铝，浓氨水，浓盐酸，镁粉，亚硝酸钠（以上均为国产分析纯），实验所用水均为蒸储水。1.3实验仪器电热恒温水浴锅电子大平（感量 0.0001g ）722型光栅分光光度计索氏提取器量筒（100ml,10ml ） 25ml比色管 移液管 小试管 白瓷板圆底烧瓶 100m 容量瓶锥形瓶2实验原理2.1提取原理溶剂提取原理游离黄酮黄酮昔备注乙醇溶解范围广+（甲醇）昔、昔元均可溶（ 90-95%） （60%）甲醇毒性大沸水 多糖昔易于水+成本低，安全，水溶性杂质多碱性水或稀氢氧化钠溶出能力强碱性乙醇 酚

2、羟基的酸性 +石灰水除杂质效果好12.2分离方法及原理（一）溶剂萃取法分离依据：'黄酮与杂质'（昔与昔元 之间的极性（分配系数K）差异苔元与苔元J分离工艺:石油酸液 乙醒液（脂溶性杂质）II回收昔元原料的提取平缩液（水溶液） 依次以石油醒、乙醍、 乙酸乙酯，水饱和正丁 萃取 J I 乙酸乙酯水饱和正丁醇母液（水溶性杂质） 回收减压回收ut单糖着 多糖昔（二）pH梯度萃取法分离依据：游离黄酮类化合物的酸性差异（见黄酮酸性规律） 分离工艺：总游离黄酮的乙醍液依次以5SNaHCOs . 5%NawC（h、 0.2%NaOL 4%NaOH萃取 wpUJP5%NaHCO3液5%Na2CO

3、3液 0. 2%N*）H液4%NaOH液每液酸化 II脂溶性杂质）1, 4X -OH黄酮 7或V -OH黄酮 一*OH黄酮黄酮3实验部分3.1原料的预处理金星科厥类叶除杂水洗晾干粉碎 3.2芦丁一标准溶液的配制将芦丁在干燥箱里用120C条件下恒重1.5h,然后精确称取芦丁标准品0.01g用85%勺乙醇溶液配制成100.00mL的溶液，备用。 3.3测定波长的选择精确移取芦丁标准溶液0.50mL,置于25.00mL的比色管中，用质量分数为85%勺乙醇稀释到10.00mL处，加人5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加入10%肖酸铝溶液0.80mL ,混匀， 放置10min,再加

4、入4%勺氢氧化钠溶液10.00mL,混匀，放置10min，加入85%勺乙醇溶液至刻度，摇 匀，10min后在460560nm处测定吸光度，4（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长。 3.4芦丁标准曲线的绘制精确吸取芦丁标准溶液 0.00、0.50、1.00 > 2.00 > 3.00、4.00 mL于6支25.00mL的比色管中， 用质量分数为85%勺乙醇稀释到10.00mL处，加人5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加 入10骚肖酸铝溶液0.80mL ,混匀，放置10min,再加入4%勺氢氧化钠溶液10.00mL,混匀，放置10min, 加入85%勺乙醇溶液至刻

5、度，摇匀， 10min后于波长500nm处测定吸光度，（以第一瓶为空白溶液） 然后以吸光度和芦丁溶液浓度做图，绘制标准曲线。3.5黄酮类化合物的特征性实验5-6在一定条件下对提取的黄酮类化合物进行特征性实验，具体内容如下：（1）盐酸一镁粉反应：取 1.00mL提取液于试管中加适量镁粉摇匀，再加入浓盐酸数滴（1次加入），观察其泡沫颜色。（2）三氯化铝反应：取提取液点在滤纸上，滴加1%E氯化铝乙醇溶液，吹干，观察颜色变化。 （3）三氯化铁反应：取几滴提取液于白瓷板上，滴加1%E氯化铁乙醇溶液，观察其颜色。（4）浓氨水反应：取乙醇提取液点在滤纸上，将滤纸在浓氨水上方熏0.5min ,观察其颜色变化。

6、 3.6 单因素实验 2.6.1较佳提取剂质量分数的确定准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇、95% 85% 80%、75%的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80C下回流提取3h.提取完毕，用与提取剂的质量分数相同的乙醇反复洗涤圆底烧瓶、滤纸包，将其定容于100:00mL容量瓶中，然后精确吸取0.50mL提取液置于25.00mL的比色管中，用与提取剂质量分数相同的乙醇稀释到10.00mL处，加人5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加入10骚肖酸铝溶液0.80mL ,混匀，放置10min，再 加入4%勺氢氧化钠溶液10.00mL,混匀，

7、放置10min，加入85%勺乙醇溶液至刻度，摇匀， 10min后 于波长500nm处测定其吸光度，同时做三组平行实验。2.6.2 较佳提取时间的确定准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用 2h、2.5h、3h、3.5h提取时 间用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80C下回流提取，乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。2.6.3较佳提取温度的确定称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在75C、80 C、85C、90 C的水浴温度下用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取2.5 h,乙醇提取液的处理方法如前，测定

8、其吸光度，同时做三组平行实验。2.6.4较佳物料比的确定称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL的85%勺乙醇溶液在水浴温度为85 C下对3g金星厥科叶样品回流提取 2.5 h,乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。3.7叶绿素对黄酮类物质的影响称取15g金星厥科叶样品放于锥形瓶中用90mL的石油酰浸泡8个小时对其脱色，过滤、干燥。然后准确称取处理过的 3g金星厥科叶样品用质量分数为85%勺60mL乙醇溶液在水浴温度为85C下对其回流提取2.5h ,乙醇提取液的处理方法如前，测定其吸光度，同时做三组平行实验。 3

9、.8金星厥科叶中黄酮类化合物含量的测定精密量取石油酰处理过的提取液0.50mL,置于25.00mL的比色管中。加85%勺乙醇稀释到10.00mL,加入5%勺亚硝酸钠溶液 0.80mL,混匀，放置10min;加入10临肖酸铝溶液0.80mL ,混匀， 放置10min，再加入4%勺氢氧化钠溶液 10.00mL,混匀，放置10min，加入85%勺乙醇溶液至刻度， 摇匀，10min后于波长500nm处测定吸光度。同时做样品空白管.根据标准曲线计算提取物中黄酮类化合物的含量.（把样品所测得吸光度的平均值代入标准曲线方程，再算出0.50mL提取液中黄酮类化合物的浓度，然后再根据浓度算出样品 中黄酮类化合物

10、的百分含量.）计算方法（公式）如下：设样品中黄酮类化合物的含量为，稀释以后的浓度为 C;原提取液的浓度为 C0 ;=Co 100mlC-V入 3.000g 1000o Vo4结果与讨论4.1最大吸收波长的选择将定量的黄酮提取液显色以后在460560nm处测定吸光度，（以试剂样品做空白）选择最大吸收波长，测定结果如下：4表1 波长与吸光度的关系波长(nm) 吸光度(A) 波长(nm) 吸光度(A)从表1中可以知道当波长在什么时候有最大吸收波峰。4.2芦丁的标准曲线的绘制精确吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL的芦丁标准溶液稀释、显色以后在波长 500nm处测定吸光

11、度(以第一瓶为空白溶液)，以浓度 (c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线， 结果如下：表2芦丁溶液浓度与吸光度的关系浓度(mg/mL)0.0020.0040.0080.0120.016吸光度实验结果表明黄酮类化合物含量在0100ug/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，其回归方程为Y=11.5548X-0.00406 R=0.99342, 4.3黄酮类化合物的特征性实验对所提取的黄酮类化合物进行特征性实验的结果如下表：表3定性实验结果试剂现象盐酸一镁粉1%三氯化铝1%三氯化铁浓氨水从表3可知，黄酮类化合物的特征性实验结果较符合黄酮类化合物的特征颜色反应，证明所提取中含有黄酮类化合物

12、。4.4单因素实验的结果4.4.1较佳提取剂质量分数的确定准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用无水乙醇、95% 85% 80%、75%的乙醇60mL对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80C下回流提取3h.显色后测其吸光度，测定结果如下：表4不同乙醇质量分数对西山中黄酮类物质提取的结果 乙醇的质量分数 (%)无水乙醇95858075吸光度2吸光度3平均值4.4.2较佳提取时间的确定准确称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用 2h、2.5h、3h、3.5h提取 时间用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品在水浴温度为80C下回流提取。显色后测其吸光度，测定结果如

13、下：表5不同提取时间对西山中黄酮类物质的提取结果提取时间(h)22.533.5吸光度1吸光度2吸光度3平均值4.4.3较佳提取温度的确定称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别在 75 C、80 C、85 C、90 C的水浴 温度下用60mL 85%勺乙醇对3g金星厥科叶样品回流提取 2.5 h。显色后测其吸光度，测定结果如下：表6 不同提取温度对西山中黄酮类物质的提取结果提取温度（C）75808590吸光度1吸光度2吸光度3平均值4.4.4较佳物料比的确定称取3g处理好的金星厥科叶样品置于圆底烧瓶中，分别用30mL 45mL、60mL、75mL、90mL质量分数为85%勺乙醇在水浴温度为 85C下对3g样品回流提取2.5 h。显色后测其吸光度，测定结 果如下：表7不同物料比对 金星厥科叶 中黄酮类物质的提取结果物料比（w/v）1:101:151:201:251:30吸光度1吸光度2吸光度3平均值4.5叶绿素对黄酮类物质含量测定的影响准确称取用石油酰脱色过的3g金星厥科叶样