青蒿素的制备实用教案

1、2011年，屠呦呦在美国纽约举行(jxng)的拉斯克奖颁奖仪式上领奖。黄花(hunghu)蒿Artemisia annua L.第1页/共24页第一页，共24页。青蒿素研究历史青蒿素的结构与抗疟机理生物(shngw)合成青蒿素第2页/共24页第二页，共24页。 疟疾(n ji)是一种由疟原虫造成的，通过疟蚊传播的全球性急性寄生虫传染病。又称瘴气、打摆子。研究(ynji)背景第3页/共24页第三页，共24页。据世界卫生组织(WHO)2011年世界疟疾报告数据，2010年全球106个疟疾流行(lixng)国家和地区共有2.16亿疟疾病例，死亡65.5万人，其中86的受害者是5岁以下的儿童。2008

2、年全球疟疾流行(lixng)分布图第4页/共24页第四页，共24页。 20世纪60年代为了援外和战备紧急任务的需要针对疟疾防治的要求，国家科委、中国人民解放军总后勤部于1967年5月23日召开了疟疾防治药物研究工作协作会议组织全国有关卫生、医药、科研、医疗(ylio)、教学、生产的60多个单位的500多位研究开展抗疟新药的研究(即523项目任务)。第5页/共24页第五页，共24页。第6页/共24页第六页，共24页。青蒿素及其衍生物的化学(huxu)结构青蒿素 (Artemisinin)，C15H22O5 ，是具 有 “ 过氧桥” 结构(jigu)的倍半萜内酯。它是倍半萜烯的衍生物。倍半萜烯又称

3、倍半萜，萜烯系统(C5H8)n中n=3的一类化合物，即三个异戊二烯单位(dnwi)的聚合体，可分为链状、单环、三环和四环。在植物体以甲羟戊酸为原料合成。常见倍半萜类化合物：第7页/共24页第七页，共24页。第8页/共24页第八页，共24页。几种(j zhn)可能的抗疟机制：青蒿素类衍生物含有过氧化桥结构，在Fe()或者其他还原性物质作用下产生一些活性中间体(包括自由基、Fe(IV)=O、 亲电中间体和活性氧等)这些中间体通过过氧化膜脂质、干扰线粒体的功能、烷基化、与疟原虫的 蛋白质作用等途径杀死疟原虫在硫酸亚铁或铁蛋白的催化下裂解产生自由基，攻击疟原虫细胞膜和胞内膜结构，或直接氧化破坏膜蛋白质

4、分子导致(dozh)细胞死亡；当青蒿素产生自由基后，在烷化底物存在时还能以共价键的方式与疟原虫蛋白质结合，使疟蛋白烷基化青蒿素显著抑制疟原虫细胞内的PfATP6酶活力(疟原虫体内唯一的SERCA型钙离子调节酶)，干扰能量代谢。青蒿素还可能开放白细胞膜上的离子通道，使细胞内钙离子浓度升高而激活卡配因，导致(dozh)胱冬酶非依赖性细胞胀亡；青蒿素作用于疟原虫和某些肿瘤细胞，能减少钾离子内向流动，使细胞线粒体跨膜电位下降，导致(dozh)促凋亡物质释放，激活胱冬酶导致(dozh)细胞死亡；青蒿琥酯作用于HL-60早幼粒白血病细胞，抑制生存蛋白的基因表达。第9页/共24页第九页，共24页。生物代谢：

5、青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。近年来的研究表明，植物类异戊二烯的生物合成至少(zhsho)存在两条途径，即细胞质内的甲羟戊酸途径(MVA途径)和质体内的丙酮酸/磷酸甘油醛途径。青蒿素等倍半萜类的生物合成途径属于甲羟戊酸途径。*甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway）是以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸(IPP) 和二甲烯丙基焦磷酸(DAMPP) 的一条合成代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。生物(shngw)合成青蒿素的研究ATP 酶、或光能合成代谢构件分子生物聚合体第10页

6、/共24页第十页，共24页。1 从乙酰CoA到法尼基焦磷酸(FDP)2 从法尼基焦磷酸 (FDP)到青蒿素(Artemisinin)合成(hchng)青蒿素的代谢途径可划为两个阶段：第11页/共24页第十一页，共24页。1 从乙酰辅酶(f mi)A到法尼基焦磷酸(FPP)*为关键(gunjin)酶第12页/共24页第十二页，共24页。甲羟戊酸代谢(dixi)反应式第13页/共24页第十三页，共24页。*Towler 和Weathers 用两种化学试剂分别抑制 MVA途径(tjng)和MEP途径(tjng)，然后分析青蒿素含量的变化。结果发现，这两个 异戊烯焦磷酸(IPP )合成途径(tjng)

7、被抑制后，青蒿素的含量都显著降低。这表明，青蒿素生物合成所需的 IPP 前体有MVA途径(tjng)和MEP途径(tjng)共同提供，胞质里面的IPP 和质体里面的IPP 可以相互补偿。第14页/共24页第十四页，共24页。*曾庆平.青蒿素合成生物学及代谢工程研究进展J. 中国科学(kxu), 2011 *实线箭头表示已被证实的反应步骤, 虚线箭头表示推测或未被证实的反应步骤; 粗线箭头表示主要反应步骤, 细线箭头表示次要反应步骤; 单箭头表示一个反应步骤, 多箭头表示多个反应步骤 2 从法尼基焦磷酸(FDP)到青蒿素第15页/共24页第十五页，共24页。 从天然产物(chnw)中萃取 化学合

8、成法 生物法青蒿素的制备(zhbi)方法培育高产青蒿素的转基因青蒿通过调节激素及发育基因表达促进青蒿素合成在微生物(酵母)体内合成青蒿素在异种植物(烟草)体内合成青蒿素青蒿细胞的培养第16页/共24页第十六页，共24页。代谢工程：通过基因工程的方法(fngf)，人为在DNA分子水平上，改变和控制细胞的代谢，使目的产物大量生成。即利用重组DNA技术，对生物细胞内固有代谢途径进行定向改造，赋予细胞新的代谢途径或增强已存在的代谢途径，尽可能的提高目的代谢产物的代谢产率。酵母(jiom)内合成青蒿素与青蒿一样，酵母是真核生物、存在糖酵解过程以及甲羟戊酸途径，但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出许多，而且

9、其培养条件容易控制(kngzh)。所以相比青蒿，酵母体内合成更高效、高产。第17页/共24页第十七页，共24页。1 Jay D Keasling. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nature Biotechnology, 2003,21:796-8022 J D Keasling. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature,

10、2006, 440:940-9433 P Covello. Molecular cloning of an aldehyde dehydrogenase implicated in ar temisinin biosynthesis in Artemisia annua . Botany, 2009, 87: 635642 Patrick CovelloNRC Plant Biotechnology InstituteJay D KeaslingBerk eley, CA, USA第18页/共24页第十八页，共24页。青蒿及其他高等植物与酵母等真核微生物合成法呢基焦磷酸的酶促反应(fnyng)

11、完全相同( 循甲羟戊酸途径)。第19页/共24页第十九页，共24页。*在表达了CYP71AV1和CPR的S. cerevisiae菌株 EPY224中设计的青蒿酸生物(shngw)合成路径示意图 摘自J D Keasling“抗疟药物前体青蒿酸在工程菌中的生产”，Nature,2006, 440:940-943第20页/共24页第二十页，共24页。得到青蒿中这种特异的细胞色素P450基因步骤(bzhu)如下：高度高度(god)(god)特异的简并引特异的简并引物物青蒿青蒿(qn ho)(qn ho)毛状体细胞的互毛状体细胞的互补补DNADNA库库PCR、凝胶电泳回收等几个特定的几个特定的p450p450片段片段一个青蒿一个青蒿P450P450基因基因片段片段与之对应的与之对应的mRNAmRNA完整完整P450cDNAP450cDNA（CYP71AV1CYP71AV1） RT -PCRRT -PCR 转录转录BLAST分析法将这些片段与向日葵和莴苣的EST比对，我们惊奇地发现有一个青蒿P450基因片段与来自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似第21页/共24页第二十一页，共24页。转基因酵母在生产青蒿酸时需要(xyo)的生物量与青蒿相比： 青蒿素(酸)含量胞体干重4.5%地上部分干重0.