MHC多聚体分子免疫学

1、分子免疫学分子免疫学专题专题12主要主要组织组织相容性复合物（相容性复合物（MHC）、）、MHC类类似分子及其多聚体的似分子及其多聚体的应应用用授授课课老老师师：翁秀芳：翁秀芳主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC): 位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群基因群,其编码产物参与抗原提呈、制约细胞间相互作其编码产物参与抗原提呈、制约细胞间相互作用及诱导免疫应答，是介导移植排斥反应的主要抗原用及诱导免疫应答，是介导移植排斥反应的主要抗原。* 人类人类MHC HLA复合体复

2、合体 编码编码HLA抗原抗原; * 小鼠小鼠MHC H-2复合体复合体 编码编码H-2抗原抗原;1936年年 Peter A.Gorer 用近交用近交系小鼠系小鼠发现发现小鼠的移植排斥小鼠的移植排斥现现象象同种异同种异型移植型移植同种同同种同型移植型移植决定移植排斥反应的基因：血细胞抗原决定移植排斥反应的基因：血细胞抗原2基因基因H-2系统系统1948年证明了年证明了H-2基因复合体基因复合体肾移植后出现的排斥反应肾移植后出现的排斥反应人白细胞表面的某种抗原人白细胞表面的某种抗原人类白细胞抗原人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）1954年，年，J.Daus

3、set 发现了人类的发现了人类的MHCHLA系统。系统。1963年，年，B.Benacerraf发现了免疫应答（发现了免疫应答（Ir）基因，并）基因，并发现发现Ir基因与基因与MHC紧密连锁。紧密连锁。HLA Class II DP LMP/TAPDM DQ DR 1BCAHLA Class I1452965626ABCNo ofpolymorphisms 38522813835107DRDPDQNo ofpolymorphismsMHC 多态性多态性 1 3 2 2m 2 1 2 1Class II(HLA-DR)Class I（ （HLA-A,B,C） ）HLA提呈抗原提呈抗原肽肽的多的多

4、样样性性pMHC作为作为T细胞特异性的结合配体细胞特异性的结合配体多样性机制多样性机制 g d g d V 70 52 10 7 D 0 2 0 2 J 61 13 2 2组合多样性组合多样性 4.3x103 1.4x103 20 28 N序列插入序列插入 5.5x103 3.0 x107 5.5x103 1.6x1011V区基因数区基因数 5.8x106 6x102连接多样性连接多样性 2x1011 1013总总 计计 1018 1015T细细胞与胞与TCR的多的多样样性性TCR与与pMHC特异特异性性结结合的可能合的可能应应用用领域？领域？pMHC作为作为T细胞特异性的结合配体细胞特异性的

5、结合配体检测抗原特异检测抗原特异性性T细胞细胞pMHC与TCR结合后作用的双面性特特异异性性增增强强特特异异性性抑抑制制T T细胞的双信号识别细胞的双信号识别pMHC作为作为T细胞特异性的结合配体细胞特异性的结合配体抗肿瘤抗肿瘤抗感染抗感染抗移植排斥抗移植排斥抗自身免疫抗自身免疫检测抗原特异检测抗原特异性性T细胞细胞可溶性可溶性pMHC与与TCR的亲和力低的亲和力低MHCMHC多聚体多聚体抗原特异性抗原特异性T细胞检测细胞检测与调控的重要工具与调控的重要工具pMHC多聚体技多聚体技术术的出的出现为现为TCR提供了高提供了高亲亲和力配体和力配体n1996年年Altman等人建立了等人建立了pMH

6、C 四聚体技四聚体技术术 Science, 1996, 274(5284):94-96. 被引用次数：被引用次数：2368n1993年年Porto等人建立了等人建立了pMHC二聚体技二聚体技术术 PNAS,1993, 6671-6675 pMHC四聚体技四聚体技术术n19961996年年AltmanAltman等人建立的等人建立的MHC-MHC-抗原抗原肽肽四聚体技四聚体技术术， ， 已成已成为为特异、敏感的特异、敏感的检测检测T T细细胞克隆的工具。胞克隆的工具。n解决了解决了TCR与其配体与其配体pMHCpMHC单单体低体低亲亲合力合力结结合的合的问问题题，从而，从而实现对带实现对带有特定

7、表型有特定表型TCR的的T细细胞的特异胞的特异性染色性染色 。 。npMHC四聚体的四聚体的应应用已用已经证实经证实在抗病毒、抗在抗病毒、抗肿肿瘤瘤研究中具有重要的意研究中具有重要的意义义 npMHCpMHC单单体：体： 每一个每一个MHCMHC分子与其相分子与其相应应限限制性的制性的肽肽段段结结合，并具有合，并具有酶酶催化的生物化位点催化的生物化位点 npMHCpMHC四聚体：四聚体： 4 4个生物素化的可溶性个生物素化的可溶性MHC-MHC-抗原抗原肽肽复合物复合物单单体与体与标记标记的的亲亲合素合素结结合形成的复合合形成的复合物物 pMHC I类分子四聚体结构示意图类分子四聚体结构示意图

8、* * pMHC pMHC单单体：体： 每一个每一个MHCMHC分子与其相分子与其相应应限制性的限制性的肽肽段段结结合，并具有合，并具有酶酶催化的生物化位点催化的生物化位点 * * pMHC pMHC四聚体：四聚体： 4 4个生物素化的可溶性个生物素化的可溶性MHC-MHC-抗原抗原肽肽复合物复合物单单体与体与标记标记的的亲亲合素合素结结合形成的复合物合形成的复合物MHC 四聚体结构示意图四聚体结构示意图HLA 四聚体种四聚体种类类nHLA I类类分子：分子：HLA-A2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A28 ， ，HLA-B8, HLA-B27等等 nHLA II类类分子：分

9、子：HLA-DR1, HLA-DR4, HLA-DQ 等等 n非非经经典典MHC分子：分子：HLA-E, HLA-F HLA-G,等等nMHC类类似分子：似分子：CD1d， ， MR1MHC/抗原肽四聚体制备过程示意图抗原肽四聚体制备过程示意图MHC/抗原抗原肽肽四聚体四聚体pMHC四聚体与四聚体与TCR的特异性的特异性结结合合n检测检测抗原特异性抗原特异性T细细胞胞n分分选选抗原特异性抗原特异性T细细胞克隆胞克隆n刺激抗原特异性刺激抗原特异性T细细胞胞n调节调节抗原特异性抗原特异性T细细胞胞MHC四四聚体检聚体检测抗原测抗原特异性特异性T细胞细胞四聚体对特异性四聚体对特异性CTL的检测的检测

10、 MHC抗原肽抗原肽特异特异CD8+T细细胞频率胞频率(%)HIVHuman HLA-A2*0201Gag77-850.8 (PBMC)HIVHuman HLA-A2*0201Pol476-4840.8 (PBMC)HIVHuman HLA-B*3501Env77-852.7 (PBMC)EBVHuman HLA-A2*0201BMLF16 (PBMC)EBVHuman HLA-B8BALF144 (PBMC)SIVMonkey Mamu-A*01Gag191-18910.3 (PBMC)LCMVMouseH-2LdNP118-126 56 (spleen)Virus SpeciesMHC四聚

11、体四聚体检测检测特异性特异性T细细胞的胞的频频率率 n通通过过四聚体四聚体测测得的病毒感染的急性期与得的病毒感染的急性期与记忆记忆期病毒期病毒特异性特异性CD8+T细细胞是原先估胞是原先估计值计值的的10倍倍 n惊人的体内抗原特异性惊人的体内抗原特异性T细细胞增胞增长长速度，在速度，在LCMV感感染的染的3-5天，抗原特异性天，抗原特异性T细细胞增倍的胞增倍的时间时间只需只需6-8小小时时。 。 n与原与原认为认为的在病毒感染免疫的在病毒感染免疫应应答中大部分答中大部分T细细胞增胞增殖是非特异性相反，四聚体染色殖是非特异性相反，四聚体染色结结果果说说明明T细细胞的免胞的免疫疫应应答主要都是答主

12、要都是针对针对病毒抗原，非特异的活化很少病毒抗原，非特异的活化很少 了。了。MHC多聚体检测抗多聚体检测抗原特异性原特异性T细胞的基细胞的基本原理？本原理？ pMHC与与TCR的特异性结合提供了结构基础的特异性结合提供了结构基础 pMHC多聚化为检测抗原特异性多聚化为检测抗原特异性T细胞提供了足细胞提供了足够的亲和力。够的亲和力。 pMHC多聚体引入的荧光标记实现了抗原特异性多聚体引入的荧光标记实现了抗原特异性T细胞的流式检测细胞的流式检测 pMHC四聚体分四聚体分选选抗原特异性抗原特异性T细细胞胞pMHC四聚体刺激抗原特异性四聚体刺激抗原特异性T细细胞胞产产生生亲和素亲和素B7pMHC提供第

13、一活化信号提供第一活化信号B7与与T细胞的细胞的CD28结合提供共刺激信号结合提供共刺激信号生物素化的生物素化的pMHC自身免疫及移植物排斥自身免疫及移植物排斥 nMaile等人等人利用雌性利用雌性HY-TCR转转基因鼠模型基因鼠模型对对其移植雄性鼠的皮肤，其移植雄性鼠的皮肤，n体内注射体内注射HY-I类类分子四聚体分子四聚体发现发现可可诱导诱导特异性的特异性的CD8+T细细胞活化，胞活化，n但若成倍增加注射四聚体的但若成倍增加注射四聚体的剂剂量，量，则则通通过诱导过诱导T细细胞无能或胞无能或AICD反反应应清清除雄性特异性的除雄性特异性的CD8+T细细胞，在体内胞，在体内诱导诱导特异性特异性

14、T细细胞耐受胞耐受. .pMHCpMHC四聚体在四聚体在肿肿瘤免疫治瘤免疫治疗疗的潜力的潜力 nOgg与与Robert等人等人报导报导了一种新的抗瘤策略：了一种新的抗瘤策略：应应用用肿肿瘤特异性的抗体与瘤特异性的抗体与pMHCpMHC四聚体四聚体结结合形成复合物，通合形成复合物，通过过特异性抗体靶向特异性抗体靶向结结合于合于肿肿瘤瘤细细胞表面胞表面从而使从而使肿肿瘤瘤细细胞胞对对四聚体特异性的四聚体特异性的CTL的溶解效的溶解效应应敏感。敏感。 pMHC 二聚体的构建策略二聚体的构建策略MHC二聚体二聚体pMHC pMHC二聚体二聚体对对抗原特异性抗原特异性T细细胞的胞的检测检测利用利用pMH

15、C二聚体二聚体诱导诱导抗原特异性抗原特异性T细细胞胞利用加载利用加载pMHC二聚二聚体的细胞作为抗原提体的细胞作为抗原提呈细胞呈细胞该抗原提呈细胞仅提该抗原提呈细胞仅提呈单一表位呈单一表位适用于诱导普通抗原适用于诱导普通抗原特异性特异性T细胞与同种抗细胞与同种抗原特异性原特异性T细胞细胞n在体外制在体外制备肿备肿瘤抗原特异性瘤抗原特异性T细细胞，探索抗胞，探索抗肿肿瘤的瘤的有效方法。有效方法。n在体外在体外诱导诱导病毒抗原特异性病毒抗原特异性T细细胞，胞，寻寻求打破慢性求打破慢性病毒感染的新的途径。病毒感染的新的途径。n获获得得单单一表位特异性一表位特异性T细细胞，研究胞，研究T细细胞的胞的识

16、别识别与与效效应应机制机制利用利用pMHC二聚体二聚体诱导诱导抗原特异性抗原特异性T细细胞胞可溶性可溶性pMHCpMHC二聚体特异性抑制抗原特异性二聚体特异性抑制抗原特异性T T细胞细胞 可溶性可溶性pMHC二聚体诱导特异性二聚体诱导特异性T细胞耐受的示意图细胞耐受的示意图可溶性可溶性pMHCpMHC二聚体特异性抑制抗原特异性二聚体特异性抑制抗原特异性T T细胞细胞u 可溶性可溶性pMHC二聚体在抗移植排斥反应中的应用二聚体在抗移植排斥反应中的应用 OHerrin等人利用小鼠可溶性等人利用小鼠可溶性pMHC I 类分子二聚体体类分子二聚体体 外诱导同种外诱导同种T细胞耐受细胞耐受 Fried等

17、人应用大鼠等人应用大鼠pMHC二聚体实现体内保护同种二聚体实现体内保护同种 移植物的作用移植物的作用u 可溶性可溶性pMHC二聚体在抗自身免疫性疾病中的应用二聚体在抗自身免疫性疾病中的应用 Masteller等人应用等人应用pMHC II类分子作为治疗性的生物分子应用于转类分子作为治疗性的生物分子应用于转 TCR而产生的糖尿病的老鼠。而产生的糖尿病的老鼠。 实验结果显示，可溶性实验结果显示，可溶性pMHC II类分子二聚体可特异性的抑制自身反类分子二聚体可特异性的抑制自身反 应性应性T细胞，诱导自身反应性细胞，诱导自身反应性T细胞耐受细胞耐受MHC多聚体的应用多聚体的应用领域？领域？1. 检测

18、检测抗原特异性抗原特异性T细细胞胞2. 分分选选抗原特异性抗原特异性T细细胞克隆胞克隆3. 诱导诱导抗原特异性抗原特异性T细细胞胞4. 调节调节抗原特异性抗原特异性T细细胞胞感染免疫感染免疫肿肿瘤免疫瘤免疫3. 自身免疫性疾病自身免疫性疾病4. 同种移植排斥反同种移植排斥反应应MHC 类类似分子似分子-MHC Ib分子分子nCD1 分子分子nMR1分子分子nH2-M3分子分子nHLA-E, HLA-G/Qa-1, Qa-2个体多个体多样样性低性低CD1分子递呈途径分子递呈途径1. CD11. CD1的特征的特征n分五型：分五型：CD1ACD1A、B B、C C、D D、E, E, 与与 2m2

19、m组成二聚体；组成二聚体；n与与MHCI/IIMHCI/II类分子有类分子有30%30%同源性，无多态性；同源性，无多态性；nCD1CD1表达于专职表达于专职APCAPC表面，还可存在于内体表面，还可存在于内体/ /溶酶体溶酶体腔室中，酸性环境改变其构象，与抗原结合。腔室中，酸性环境改变其构象，与抗原结合。2. 2. 抗原递呈特征抗原递呈特征n主要递呈糖脂或脂类抗原，特别是分支杆菌的某些主要递呈糖脂或脂类抗原，特别是分支杆菌的某些成分；成分；n递呈给递呈给CD4CD4+ +T T、CD8CD8+ +T T、CD4CD4- -CD8CD8- -T T、NK1.1NK1.1+ + T T细胞。细胞

20、。脂类抗原的脂类抗原的CD1CD1分子提呈途径分子提呈途径CD1d-限制性T细胞NKT细胞CD1d-restricted iNKT CellsIL- 4, -10, -13IFN-g gIL-17,TNF NK1.1 Surface phenotype - TCRint, NK1.1+, CD4+ or CD4-CD8- TCR usage - V14-J18 (V24-J18 in human), preferentially associate with V8, V7, and V2 Can be detected by -galactosyl ceramide(- GalCer) -lo

21、aded CD1d tetramers Rapid release of cytokines upon activationImmunological functions - immune responses against pathogens, anti-tumor immunity, autoimmunity CD1dInvariant TCRType I NKT cell (iNKT cell )APC MR1分子提呈途径Lars Kjer-Nielsen, et al, Nature, 2012, Nov, 491: 717-7231232m6-FP6-FP122m390o rotat

22、ionMR1HFEMHC-1CD1dMR1限制性限制性T细细胞胞MAIT细细胞胞* MAIT- Mucosal associated invariant T cells* Surface phenotype: Mainly DN, some CD8 in human TCR usage: Semi-invariant: mV19/mVb6, 8 hV7.2-Ja33/hVb2, 13Predominantly in the Gastrointestinal tract; abundant in human blood and liver. Absence in germ-free miceCa

23、n be detected by MR1-6-FP tetramerComparison of NKT and MIAT cells 抗原特异性抗原特异性T细细胞的胞的检测检测方法方法传统传统功能功能实验实验 依依赖赖于抗原特异性于抗原特异性T细细胞在体外的增殖活力及胞在体外的增殖活力及细细胞胞毒效力的功能毒效力的功能试验试验 n氚标记胸腺嘧啶核苷（氚标记胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入率测定）掺入率测定T细细 胞的胞的增殖增殖水平水平 MTT法测增殖法测增殖nCr51释放法检测释放法检测T细胞的特异性细胞的特异性杀伤杀伤功能功能 LDH法测杀伤法测杀伤细细胞增殖胞增殖实验实验原理原理加加3H标记的标记的DNA前体前体(3H胸腺嘧啶苷，胸腺嘧啶苷，3H-TdR)T细胞增殖表现为细胞增殖表现为DNA复制，复制，细胞合成细胞合成DNA量倍增量倍增3H-TdR掺入新合成的掺入新合成的DNA中中根据掺入的多少根据掺入的多少推测细胞增殖程度推测细胞增殖程度细细胞胞杀伤实验杀伤实验原理原理靶细胞被特异性杀伤靶细胞被特异性杀伤51Cr释放入培养上清释放入培养上清 51Cr掺入培养的靶细胞中，掺入培养的靶细胞中，使其摄入胞内使其摄入胞内 上清中的辐射强度即可上清中的辐射强度即可计算出特异性计算出特异性