第八章吸光光度法

1、仪器分析法仪器分析法采用较为特殊或复杂的采用较为特殊或复杂的仪仪器设备器设备，通过测量物质的，通过测量物质的某些某些物理物理或或物理化学物理化学性质性质参数或变化参数或变化来确定其化学来确定其化学组成、成分含量或结构的组成、成分含量或结构的分析方法分析方法 化学反应非必须条件化学反应非必须条件化学分析法化学分析法使用天平和玻璃器皿，基使用天平和玻璃器皿，基于化学反应平衡之上的试于化学反应平衡之上的试样分析方法。样分析方法。第八章第八章 吸光光度法吸光光度法化学分析化学分析分离：分离：沉淀、萃取、蒸沉淀、萃取、蒸馏馏定性：定性：直接或通过简单直接或通过简单的化学反应的化学反应测量待测物测量待测物

2、）的颜色、沸熔点、气的颜色、沸熔点、气味、光学性质（散射、味、光学性质（散射、反射、衍射等）以及在反射、衍射等）以及在不同溶剂中的溶解特性不同溶剂中的溶解特性定量：定量：重量法、容量法重量法、容量法仪器分析仪器分析分离：分离：色谱技术和毛细色谱技术和毛细管电泳管电泳定性或定量：定性或定量：利用物质利用物质原子、分子、离子等的原子、分子、离子等的特性，特性， 如如光吸收和发射光吸收和发射、电导、电导、电位、质荷比电位、质荷比、荧光、荧光结构、形态、状态分析结构、形态、状态分析及表征及表征定量分析定量分析化学分析化学分析容量分析容量分析重量分析重量分析常量组分，准确度高常量组分，准确度高仪器分析仪

3、器分析微量、痕量组分，准确微量、痕量组分，准确度较化学法差，而且不度较化学法差，而且不同方法之间差别较大同方法之间差别较大bVcaVc待测待测待测待测标准标准标准标准 可为任意数值）可为任意数值）（aackS smMMmw称量称量待测待测称量称量待测待测 aclgkS 仪器分析方法的分类仪器分析方法的分类光学分析法光学分析法电化学分析法电化学分析法色谱分析法色谱分析法（分离分析方法）（分离分析方法）热分析法热分析法其它分析方法（质谱法、中子活化分析等）其它分析方法（质谱法、中子活化分析等）联用技术联用技术光学分析法光学分析法特性特性仪器方法仪器方法说明说明光发射光发射发射光谱法、荧光发射光谱法

4、、荧光/磷光、化学发光磷光、化学发光光由待测物产光由待测物产生生光吸收光吸收分光光度分光光度、声光光谱、核磁、声光光谱、核磁/电子自旋共电子自旋共振振光与待测物作光与待测物作用后发生变化用后发生变化光散射光散射浊度法、拉曼光谱浊度法、拉曼光谱光折射光折射折光分析、干涉法折光分析、干涉法光衍射光衍射X-射线和电子衍射光谱射线和电子衍射光谱光偏转光偏转旋光分析、旋光性色散分析、圆二色性光旋光分析、旋光性色散分析、圆二色性光谱谱电化学分析法电化学分析法特性特性仪器方法仪器方法说明说明电位电位电位分析电位分析四种电学特性的测四种电学特性的测量量电荷电荷电解电解/库仑分析库仑分析电流电流-电位电位极谱（

5、伏安）分析极谱（伏安）分析电阻电阻电导分析电导分析仪器分析法的特点仪器分析法的特点灵敏度高，检测限低，适合微量、痕量、超痕量的成灵敏度高，检测限低，适合微量、痕量、超痕量的成分的测定分的测定（化学法适合常量分析）（化学法适合常量分析）选择性好选择性好操作简便，分析速度快，易于实现自动化操作简便，分析速度快，易于实现自动化相对误差较大相对误差较大（较化学法准确性低，但在不断提高）（较化学法准确性低，但在不断提高）需要比较昂贵的专用仪器需要比较昂贵的专用仪器300400500600700 /nm350525 545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2Absorbance350基于

6、物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为基于物质对光的选择性吸收而建立的分析方法称为吸光光度吸光光度法法。包括比色法、可见及紫外分光光度法等。本章主要讨论可。包括比色法、可见及紫外分光光度法等。本章主要讨论可见光区的吸光光度法。利用可见光进行吸光光度法分析时，通见光区的吸光光度法。利用可见光进行吸光光度法分析时，通常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光常将被测组分通过化学反应转变成有色化合物，然后进行吸光度的测量。例如：测量钢样中度的测量。例如：测量钢样中Mn的含量，在酸性溶液中将的含量，在酸性溶液中将Mn 氧化为氧化为MnO4-，然后进行吸光度的测量。，然后进行吸光度的测量。

7、 t0IIlgT1lgA（一）灵敏度高（一）灵敏度高吸光光度法常用于测定试样中吸光光度法常用于测定试样中10.001%的微量组分。的微量组分。对固体试样一般可测至对固体试样一般可测至10-4 %。（二）分析微量组分的准确度高（二）分析微量组分的准确度高例如：含铁量为例如：含铁量为0.001%的试样，如果用滴定法测定，称的试样，如果用滴定法测定，称量量1g试样，仅含铁试样，仅含铁0.01mg，无法用滴定分析法测定。如果用，无法用滴定分析法测定。如果用显色剂显色剂1，10-邻二氮菲与亚铁离子生成邻二氮菲与亚铁离子生成橙红色橙红色的的1，10-邻邻二氮菲亚铁配合物，就可用吸光光度法来测定。二氮菲亚铁

8、配合物，就可用吸光光度法来测定。Fe2+ + 3(1,10-phen) Fe(1,10-phen)3 2+ （三）操作简便，测定快速（三）操作简便，测定快速（四）应用广泛（四）应用广泛几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可直接或间接地用分光光度法测定。可用来研究化学反应的机理、溶液中地用分光光度法测定。可用来研究化学反应的机理、溶液中配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。配合物的组成、测定一些酸碱的离解常数等。与化学分析法比较它具有如下特点：与化学分析法比较它具有如下特点： 8-1 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理一、物质对光的选择吸收一、

9、物质对光的选择吸收当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生了反射、散射、吸收或透射（了反射、散射、吸收或透射（p238, 图图9-1）。）。若被照射的是若被照射的是均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。均匀的溶液，则光在溶液中的散射损失可以忽略。 当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光当一束由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色的光复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液复合而成的白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。当透射光波长在吸收，另一些波长的光则透过。当透射光波长在400

10、-760nm范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为可见光。范围时，人眼可觉察到颜色的存在，这部分光被称为可见光。透射光和吸收光呈互补色，即透射光和吸收光呈互补色，即物质呈现的颜色是与其吸收光物质呈现的颜色是与其吸收光呈互补色的透射光的颜色呈互补色的透射光的颜色。 例如：例如：CuSO4溶液由于吸收了溶液由于吸收了580-600 nm的黄色光，呈的黄色光，呈现的是与黄色呈互补色的蓝色。不同波长的光具有不同的颜现的是与黄色呈互补色的蓝色。不同波长的光具有不同的颜色，见色，见P238，表，表9-1。 可见光区物质吸光与颜色的关系可见光区物质吸光与颜色的关系互补互补 /nm颜色颜色互补光互补光

11、400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发物质吸收了光子的能量由基态跃迁到较高能态（激发态），这个过程叫做物质对光的吸收。态），这个过程叫做物质对光的吸收。M（基态）（基态）+h M*(激发态激发态) 当照射光光子的能量当照射光光子的能量h与物质的基态与激发态能量之差相等与物质的基态与激发态能量之差相等时，即时，即E= h，才能发生吸收。，才能发生吸收。 不同的物质由于结构

12、不同而具有不同的能级差，所以吸不同的物质由于结构不同而具有不同的能级差，所以吸收不同波长的光。物质对不同波长光吸收能力的分布情况，收不同波长的光。物质对不同波长光吸收能力的分布情况，称为称为吸收曲线吸收曲线，也称为，也称为吸收光谱吸收光谱。吸收曲线以波长为横坐标，。吸收曲线以波长为横坐标，吸光度为纵坐标。每种物质的吸收曲线，一般都有一个最大吸光度为纵坐标。每种物质的吸收曲线，一般都有一个最大吸收峰，最大吸收峰所对应吸收峰，最大吸收峰所对应的波长叫做的波长叫做最大吸收波长最大吸收波长max。定量分析基础定量分析基础420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 6

13、20 640A1.00.50 样样品品池池1c2c3c4c 由由P239，图，图9-3可以看出：不同浓度的可以看出：不同浓度的1，10-邻二氮杂邻二氮杂菲亚铁溶液对不同波长的光吸收情况不同，其最大吸收波菲亚铁溶液对不同波长的光吸收情况不同，其最大吸收波长位于长位于510nm，即吸收的是绿光，呈现的是相应的互补色，即吸收的是绿光，呈现的是相应的互补色橙红色。当溶液浓度增大时，吸光度增大，但最大吸收波橙红色。当溶液浓度增大时，吸光度增大，但最大吸收波长长max不变。在吸光光度法分析中，一般都在最大吸收波不变。在吸光光度法分析中，一般都在最大吸收波长处测量吸光度。长处测量吸光度。二、光吸收的基本定律

14、二、光吸收的基本定律、朗伯、朗伯-比耳定律比耳定律1729年波格（年波格（Bouguer）建立了吸光度与吸收介质厚度）建立了吸光度与吸收介质厚度之间的关系。之间的关系。1760年朗伯（年朗伯（Lambert）用更准确的数学方法）用更准确的数学方法表达了这一关系。表达了这一关系。1852年比耳（年比耳（Beer）确定了吸光度与溶液）确定了吸光度与溶液浓度及液层厚度之间的关系，建立了光吸收的基本定律，称浓度及液层厚度之间的关系，建立了光吸收的基本定律，称为为朗伯朗伯-比耳定律比耳定律。当一束平行单色光通过液层厚度为当一束平行单色光通过液层厚度为b、吸光物质的浓度、吸光物质的浓度为为c的单一均匀的，

15、非散射的有色溶液时的单一均匀的，非散射的有色溶液时, 溶液的吸光度与溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度成正比。溶液浓度和液层厚度成正比。 A = lgI0/I = abc A：吸光度，：吸光度，A =lgI0/I ；T：透光度，：透光度，TI /I0；I0: 入射入射光强度；光强度； I: 透射光强度；透射光强度；a 称为吸光系数；称为吸光系数；b：液层厚度：液层厚度（光程长度），（光程长度），b的单位为的单位为 cm ；c为吸光物质的浓度，为吸光物质的浓度， 若若c的单位为的单位为g /L，则，则a的单位为的单位为Lg-1cm-1。当当c的单位为的单位为mol/L，则此时吸光系数称为，则此时吸

16、光系数称为摩尔吸光系数摩尔吸光系数，用用表示，单位为表示，单位为Lmol-1cm-1，它表示，它表示1mol/L吸光物质，溶吸光物质，溶液的厚度为液的厚度为1cm时溶液对光的吸收能力。时溶液对光的吸收能力。A= bc = M a 在分光光度分析的实际工作中，不能直接取在分光光度分析的实际工作中，不能直接取1mol/L这样这样高的浓度测定摩尔吸光系数高的浓度测定摩尔吸光系数值，而是在适宜的低浓度下值，而是在适宜的低浓度下测量吸光度测量吸光度A，然后通过计算求出，然后通过计算求出值。值。 例：铁（例：铁（II）浓度为）浓度为5.010-4g /L，与，与1，10-邻二氮菲反应邻二氮菲反应生成橙红色

17、的配合物，该配合物在波长生成橙红色的配合物，该配合物在波长508nm，比色皿厚，比色皿厚度为度为2cm时，测得时，测得A=0.19，计算该配合物的，计算该配合物的a及及 。解：解：a=A/bc=0.19/(25.010-4)=190Lg-1cm-1 =A/bc=0.19/(25.010-4/55.85) =1.1104 LmoL-1cm-1或或 = M a55.85190=1.1104 LmoL-1cm-1通常认为通常认为 104的显色反应是灵敏的，的显色反应是灵敏的， 60 nm）等。等。提高灵敏度和选择性提高灵敏度和选择性 22513SCNFeSCN51Fe 例：例：浅黄浅黄无色无色血红血

18、红（三）显色剂在测定波长处无明显吸收（三）显色剂在测定波长处无明显吸收这样可使试剂空白一般较小。这样可使试剂空白一般较小。 （四）有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定（四）有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定 这样可以保证在测定过程中吸光度基本不变。这样可以保证在测定过程中吸光度基本不变。 二、显色条件的选择二、显色条件的选择显色反应能否满足光度法的要求，除了主要与显色剂的显色反应能否满足光度法的要求，除了主要与显色剂的性质有关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的。显性质有关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的。显色条件包括显色剂用量、酸度、显色温度、显色时间及干扰色条件包括显色剂

19、用量、酸度、显色温度、显色时间及干扰的消除。的消除。（一）显色剂的用量（一）显色剂的用量M(被测组分被测组分)+R（显色剂）（显色剂）= MR（有色化合物）（有色化合物）为了使显色反应尽可能进行完全，加入适当过量的显色剂为了使显色反应尽可能进行完全，加入适当过量的显色剂是必要的。但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定是必要的。但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定反而不利。在实际工作中，显色剂的适宜用量是通过实验求反而不利。在实际工作中，显色剂的适宜用量是通过实验求得的。固定被测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的得的。固定被测组分的浓度和其它条件，分别加入不同量的显色剂，测量吸光度

20、，做吸光度显色剂，测量吸光度，做吸光度 显色剂用量曲线。一般有显色剂用量曲线。一般有三种情况，见三种情况，见P248，图，图9-14，其中，其中（a）最为常见。最为常见。 在在a-b范围内曲线平直，吸光度出现稳定值，因此可在范围内曲线平直，吸光度出现稳定值，因此可在a-b间选择合适的显色剂用量。间选择合适的显色剂用量。 （二）溶液的酸度二）溶液的酸度溶液酸度对显色反应的影响可从金属离子、显溶液酸度对显色反应的影响可从金属离子、显色剂及有色配合物三方面考虑。色剂及有色配合物三方面考虑。大部分高价金属离子都易水解，显然，金属离大部分高价金属离子都易水解，显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是不

21、利的，故溶液子的水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度不能太低。的酸度不能太低。 显色剂多是有机弱酸，溶液的酸度影响着显色显色剂多是有机弱酸，溶液的酸度影响着显色剂的离解，并影响显色反应的完全程度。此外，许剂的离解，并影响显色反应的完全程度。此外，许多显色剂本身就是酸碱指示剂，溶液的酸度对显色多显色剂本身就是酸碱指示剂，溶液的酸度对显色剂本身的颜色会产生改变。剂本身的颜色会产生改变。 溶液的酸度对有色配合物的组成及稳定性也有溶液的酸度对有色配合物的组成及稳定性也有影响。因此，某一显色反应最适宜的酸度可通过实影响。因此，某一显色反应最适宜的酸度可通过实验来确定。固定待测组分及显色剂浓度，

22、改变溶液验来确定。固定待测组分及显色剂浓度，改变溶液pH，测定其吸光度，做吸光度，测定其吸光度，做吸光度-pH关系曲线，曲线关系曲线，曲线平坦部分对应的平坦部分对应的pH为适宜的酸度范围。为适宜的酸度范围。（三）显色温度（三）显色温度合适的显色温度也必须通过实验确定，做合适的显色温度也必须通过实验确定，做A-T曲线。曲线。（四）显色时间（四）显色时间 有些显色反应较慢，需放置使其显色完全。有些显有些显色反应较慢，需放置使其显色完全。有些显色配合物不够稳定，放置后会产生部分分解，导致吸光色配合物不够稳定，放置后会产生部分分解，导致吸光度降低，因此适宜的显色时间必须通过实验来确定。从度降低，因此适

23、宜的显色时间必须通过实验来确定。从加入显色剂计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘加入显色剂计算时间，每隔几分钟测定一次吸光度，绘制制A-t曲线，来确定适宜的时间。曲线，来确定适宜的时间。（五）干扰的消除（五）干扰的消除主要有三种：利用掩蔽反应、控制酸度、分离干扰离主要有三种：利用掩蔽反应、控制酸度、分离干扰离子。子。 三、显色剂三、显色剂四、三元配合物四、三元配合物 显色剂主要分为无机显色剂和有机显色剂两大类，其中有机显色剂由于大多与金属离子生成极其稳定的鳌合物，显色反应的选择性和灵敏度都较无机显色反应高，因而广泛地应用于吸光光度分析中。这部分内容可参考P249251。由于三元配合物具有独特

24、的分析特性，因而在分析化学中得到了广泛的应用。显色剂种类显色剂种类无机无机（SCN-；MoO42-；H2O2）有机有机OO型：型：磺基水杨酸磺基水杨酸NN型：型：ON型型： PAR S型型:双硫腙双硫腙OHCOOHSO3HNNNNNOH OHNH NHNSN8-4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择上节主要介绍了显色反应和显色条件的选择和控制对上节主要介绍了显色反应和显色条件的选择和控制对吸光光度法的影响，为使光度法有较高的灵敏度和准确性，吸光光度法的影响，为使光度法有较高的灵敏度和准确性，还必须控制适当的吸光度测量条件。选择合适的测量条件，还必须控制适当的吸光度测量条件。选择合适的测量

25、条件，可从下面几个方面考虑：可从下面几个方面考虑：一、入射光波长一、入射光波长入射光波长一般选择溶液具有最大吸收时的波长，以入射光波长一般选择溶液具有最大吸收时的波长，以便获得较高的灵敏度。如果在最大波长处有干扰物质的强便获得较高的灵敏度。如果在最大波长处有干扰物质的强烈吸收，则可选择次强吸收峰，见烈吸收，则可选择次强吸收峰，见p252，图，图9-15。二 、参比溶液参比溶液 为了使测得的吸光度能真实反映待测物质对光的吸收，为了使测得的吸光度能真实反映待测物质对光的吸收，必须校正比色皿、溶剂等对光的吸收造成的透射光强度的减必须校正比色皿、溶剂等对光的吸收造成的透射光强度的减弱。采用光学性质相同、厚度相同的比色皿储存参比溶液，弱。采用光学性质相同、厚度相同的比色皿储存参比溶液，调节仪器使透过参比皿的吸光度为零。也就是说，实际上是调