A细胞工程—植物花粉和花药培养

1、1会计学A细胞工程细胞工程植物花粉和花药培养植物花粉和花药培养第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养花粉和花药的培养花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指在人工是指在人工合成合成培养基上培养基上，改变花粉的发育途径改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像体细使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂胞一样进行分裂分化，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。分化，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养单倍体植物单倍体植物( (haplobiont) )用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。用离体培养花药的

2、方法使花粉发育成一个完整的植株。花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）一、概念一、概念第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养供体植株供体植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植花粉植株（株（n）雄核发育雄核发育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍纯合植株纯合植株DH（2n）一年内获得纯系一年内获得纯系常规育种需常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。1、作物育种、作物育种常规育种在杂交常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药代开始选择；花药培养在培养在F1或或F2代进行培养，再人工加倍处代进行培养，再人工加倍处

3、理缩短育种周期理缩短育种周期3-5年年克服后代分离，大大缩短育种周期克服后代分离，大大缩短育种周期第二节第二节 花药和花粉培养的应用花药和花粉培养的应用例子例子： 二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBbAaBb，若要从后代中选择基因为，若要从后代中选择基因为AAbbAAbb的纯合单株的纯合单株 常规方法常规方法： AAbbAAbb出现的概率为出现的概率为1/161/16，并且不能将，并且不能将AAbbAAbb与与AabbAabb、aAbbaAbb区分开。区分开。 AB aB Ab abABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBB aABb aaBbAbAabBAabB

4、AAbbAabbabaAbBaabB aAbb aabb 单倍体单倍体 二倍体二倍体AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供体亲本供体亲本AaBb花培 从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率代群体中，选择某一基因型的概率为为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。倍。植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代当代及时获及时获得突变个体，染色体加

5、倍后成为稳定的纯系。得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系。花粉离体培养时，雄核发花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是育最适宜的时期一般是第第一次有分裂或之前一次有分裂或之前。1、A A途径途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞细胞和生殖细胞 （1 1）A-VA-V途径途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2 2）A-GA-G途径途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3 3）A-VGA-VG途径（途径（E E途径）途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独由营养细胞和生殖细胞

6、各自独立分裂，共同形成单倍体立分裂，共同形成单倍体 （4 4）C C途径途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株体植株2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，近的两个细胞。然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株或者核融合形成多倍体植株三、雄核发育启动机理三、雄核发育启动机理四、花粉植株形态发生方式四、花粉植株形态发生方式部分花药通过胚状体途径形成小植株部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养烟草花药培养a) 球形

7、胚 d) 鱼雷形胚芸苔属小孢子培养部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药水稻花药培养愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养3、机械游离、机械游离梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）具体方法具体方法2.看护培养图解微室培养图示：微室培养图示：1滴含单细胞培养液滴含单细胞培养液周围加石蜡油周围加石蜡油旁边各加石蜡油旁边各加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片盖盖玻片平视图平视图凹穴载玻片凹穴载玻片置培养皿中置培养皿中2628 恒恒温培养温培养取花蕾（镜检）取花蕾（镜检）预培养数天预培养数天取

8、花药取花药消毒消毒分离花粉分离花粉第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术接种接种培养培养愈伤组织发生愈伤组织发生（一）白化苗产生的影响因素及机理（一）白化苗产生的影响因素及机理1 1、内因、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2 2、外因、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3 3、机理、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。小孢子发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。对诱导雄核发育非常重要。（三）花粉发育时期（三）花粉发育时期适宜时期适宜时期：单核期：单核期,

9、尤其是单核中、晚期尤其是单核中、晚期(单核靠边期单核靠边期)Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）1 1、植株生长条件、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力。一般光温等因素均能影响花药培养力。一般 处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2 2、植株生长时期、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。一般是开花始期优于开花末期。3

10、3、P P花粉的频率花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高质处理提高P花粉的数量花粉的数量 雄配子体的发育雄配子体的发育 营养细胞营养细胞生殖细胞生殖细胞精子精子四分体四分体: 醋酸洋红染色醋酸洋红染色四分体四分体: Alexanders 染色染色单核期单核期双核期双核期成熟花粉粒成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子处于不同发育时期的烟草小孢子单核晚期单核晚期液泡液泡第一次有丝分裂后期第一次有丝分裂后期双核早期双核早期双核中期双核中期生殖核生殖核生殖核生殖核营养核营养核一般而言，单核期（第一次一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最

11、有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。敏感，为最佳培养期。形成双核后，在合适的条件形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生，主要由营养细胞分裂产生胚状体。胚状体。 发育时期发育时期物种物种减数分裂期减数分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄单核早中期单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期单核早期至晚期烟草烟草单核早期至双核期单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核四分孢子期至双核期期玉米玉米l对不同发育阶段的花药对不同发育阶段的花药

12、进行培养测试进行培养测试l确定最佳小孢子发育时确定最佳小孢子发育时期的形态特征期的形态特征l注意形态特征会因品种注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件、发育状态、环境条件的变化而发生变化的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定花粉发育时期的确定醋酸洋红染色DAPI 染色预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理是小孢子培养成功的前提条件 预处理目的：预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢

13、子）。适当的预处理能使绿苗产量大胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。量增加。 预处理方法预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。低温、高温、化学物质、离心、射线等。 （四）预处理（四）预处理预处理方法：预处理方法：3 3、其它、其它l包括包括射线、离心、磁场等射线、离心、磁场等。 （五）培养基（五）培养基 1.1.基本培养基基本培养基 主要为主要为N6和和MS培养基。培养基。MS和和H培养基：培养基：适合双子叶植物花药培养；适合双子叶植物花药培养；B5培养基：培养基：适合豆科和十字花科花药培养

14、；适合豆科和十字花科花药培养；N6培养基：培养基：适合禾谷类作物的花药培养。适合禾谷类作物的花药培养。Nitsch培养基培养基:适合芸薹属和曼陀罗属。适合芸薹属和曼陀罗属。高浓度的高浓度的NH4+显著抑制花粉愈伤组织形成。显著抑制花粉愈伤组织形成。铁盐铁盐对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育对花粉胚状体发育很重要。活性炭促进胚状体发育。 包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。u不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高。u一般

15、认为一般认为单子叶植物单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。比双子叶植物需糖的浓度要高。u玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。u较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织； 较低 浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。2.2.碳源碳源3 3、激素、激素 细胞分裂素可促进胚状体形成； 生长素可诱导愈伤组织形成。 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗4 4、氨基酸、氨基酸5 5、活性碳、活性碳6 6、pHpH （六）培养条件（六）培养条件 1 1、温度、温度 物种间有差异，物种间有差异，培养温度在培养温度在2528左右左右2

16、 2、光照、光照 光暗交替培养，每天光暗交替培养，每天1218h的光照，光照强度的光照，光照强度200010000lx。3 3、植板密度、植板密度 植板密度与花培效率有很大的相关性。植板密度与花培效率有很大的相关性。5103到到2104ml密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密密度均能有效培养。一般来说，足够数量的、但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养、氧气、细胞分裂的空间，从则有利于胚状体发生。间，从则有利于胚状体发生。花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作

17、用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。（七）花药壁因素（七）花药壁因素一、倍性鉴定一、倍性鉴定二、染色体加倍二、染色体加倍第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术孤雌生孤雌生殖殖孤雄生孤雄生殖殖无配子生无配子生殖殖也称单性生殖，即卵不经过受精也能发育成正常的新个体 配子体可以不经过配子的结合，而直接产生孢子体的，这种现象叫做无配子生殖 预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培

18、养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株。形成小植株。选择合适的供体植株（选择合适的供体植株（F1？）？）倍性鉴定或染色体加倍1/21/2MS+IBA0.2mg/L+MS+IBA0.2mg/L+活性炭活性炭3 3g/L+g/L+蔗糖蔗糖2020g+g+琼脂琼脂7 7g/Lg/L第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术第一节第一节 花药和花粉培养技术花药和花粉培养技术 孢子有大小两型孢子有大小两型,其大形者称为大孢子其大形者称为大孢子 胚囊细胞胚囊细胞 embryosac cell 是种子植物的大孢子，是由

19、胚囊母是种子植物的大孢子，是由胚囊母细胞减数分裂形成的单倍的细胞，相当于苔藓植物和蕨类植物的细胞减数分裂形成的单倍的细胞，相当于苔藓植物和蕨类植物的大孢子大孢子 被子植物和裸子植物花药内的花粉四分体也称为被子植物和裸子植物花药内的花粉四分体也称为小孢子小孢子. 孢子是生物所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞，能直接孢子是生物所产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞，能直接发育成新个体。孢子一般微小，单细胞。发育成新个体。孢子一般微小，单细胞。 由于它的性状不同，发生过程和结构的差异而有种种名称。由于它的性状不同，发生过程和结构的差异而有种种名称。 生物通过无性生殖产生的孢子叫生物通过无性生殖产生的孢子

20、叫“无性孢子无性孢子”，如分生孢子、孢，如分生孢子、孢囊孢子、游动孢子等；囊孢子、游动孢子等； 通过有性生殖产生的孢子叫通过有性生殖产生的孢子叫“有性孢子有性孢子”，如接合孢子、卵，如接合孢子、卵孢子、子囊孢子、担孢子等；孢子、子囊孢子、担孢子等； 直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而能抵抗不良环直接由营养细胞通过细胞壁加厚和积贮养料而能抵抗不良环境条件的孢子叫境条件的孢子叫“厚垣孢子厚垣孢子”、“休眠孢子休眠孢子”等。等。第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养第第5章章 花药和花粉培养花药和花粉培养供体植株供体植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植花