2012CB517900-G儿童孤独症的遗传基础及其致病的机制研究

1、项目名称：儿童孤独症的遗传基础及其致病的机制研究首席科学家：夏昆中南大学起止年限：2012.1-2016.8依托部门：湖南省科技厅教育部一、关键科学问题及研究内容（一）拟解决的关键科学问题已有的研究显示，孤独症具有高度的临床异质性。由于缺乏明确的疾病相关 生化、病理、影像学等指标，孤独症的诊断均以行为障碍为依据。目前国际上孤 独症诊断评价的最佳工具被认为是 ADOS和ADI-R ,但在国内并未被推广。孤 独症的病因至今不明。流行病学调查显示孤独症的遗传度高达 90%。近年来，通 过染色体核型分析、连锁分析、GWAS、全基因组CNVs研究，已鉴定了多个相 关的位点和易感基因，但由于孤独症高度的表

2、型和遗传异质性，这些位点或基因 很少能够被重复验证。止匕外，即使是已经发现的遗传变异，也只能解释 10-20% 的患者。环境因素也被认为是孤独症的主要病因之一，但由于缺乏系统的调查与 研究，至今尚未发现确切的与孤独症发生有关的环境因素。最近几年，关于孤独症的神经生物学机制研究取得了一些重要的进展，对多个孤独症高度相关基因的 功能研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路的异常可能 是孤独症发生的重要分子机制。但总体而言，关于孤独症的分子致病机制研究还 处于早期阶段，易感基因究竟通过什么机制参与疾病的发生、 发展，其中所包含 的调控机制是什么仍然是当前孤独症研究的重大问题。根据目前

3、的研究现状，我们提出 2个需要解决的科学问题：1、孤独症的遗传学基础：已有的研究显示，孤独症的易感位点或基因很难 被重复验证。我们认为其根本原因在于孤独症具有高度的临床异质性，同时缺乏有效的疾病相关生化、病理、影像学等特征及临床内表型和亚型分类， 导致孤独 症易感基因研究中入组样本实际存在较大的不同质性。止匕外，多数研究以ASD、而不是典型的孤独症患者为研究对象， 进一步导致了研究样本的不同质性。 而决 定其不同质性的主要原因是由于孤独症的遗传基础较非常复杂，染色体异常、 CNVs、罕见基因变异、GWAS发现的常见变异等均与孤独症有关。尽管近年来 孤独症的遗传基础研究取得了很大的进展，但将所有

4、已发现的遗传因素合并起 来，也仅能解释10-20%的孤独症患者。因此，进一步鉴定孤独症的易感基因、 确定不同类型变异在疾病发生中的贡献度仍然是阐明孤独症遗传学基础的重要 问题。通过鉴定孤独症临床内表型，进行临床亚型分类，并在此基础上鉴定易感基因是解决这一问题的关键。2、孤独症的神经生物学机制： 已有研究表明，神经发育、神经元可塑性、突触连接功能以及神经环路的异常似乎是导致孤独症发生的重要原因。然而，现有的研究尚未阐明孤独症发生、发展过程中神经元的生物学特征和功能、 以及神 经环路等的改变及相关调控机制。 在疾病发生中，除了已知的少数通路之外，还 有哪些分子、通过什么信号途径、生物学通路和调控机

5、制来参与疾病的病理过程 尚属未知。止匕外，由于遗传基础复杂，至今没有一个合适的孤独症动物模型，从 而制约了疾病的发病机理研究进程。因此，在准确鉴定孤独症易感基因的基础上， 选择合适的模型和策略开展神经生物学研究是阐明其发病机理的关键。(二)主要研究内容根据孤独症的研究现状及拟解决的科学问题，我们提出如下科学假说：孤独 症具有明显的遗传易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以 SNPs 等常见变异为代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常、新发CNVs和罕见 基因突变等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础，并且在环境因素以及表观遗传异常的作m下造成神经发育、 和神经环路异常

6、，最终导致孤独症表型的出现。;(. ( 曷感遽传背景 LJ、11II " .1表双递 传异常4I神经元可望性.突触连接功能.1裨环路异常 nr册独隹内表型L g o、a独症表型神经兀口塑性、突触连接功能 1罕见突变,新<发 CNMs 1_-_ . r坏境J具体研究内容包括以下四个方面：1、鉴定孤独症的临床表型和内表型：由于尚未发现特定的孤独症病理学特 征，目前的诊断仅依赖ADOS, ADI-R等行为学量表，与其他神经精神疾病不同的是，孤独症高度的表型异质性加大了临床诊断的难度。本项目将充分发挥项目组孤独症临床实践和临床基础研究国内领先的优势， 在建立孤独症临床和遗传资 源库的基

7、础上，详细鉴定孤独症的临床特征，特别注重孤独症患儿的社交障碍、 语言障碍、刻板行为等核心症状，并利用生化、电生理、脑成像等技术发现潜在 的内表型，建立孤独症核心症状等表型和内表型数据库，为诊断提供客观指标， 为孤独症的病因学研究、特别是基于特征表型的样本入组提供科学支撑。2、孤独症的遗传学基础研究：过去近十年的遗传学研究已鉴定了数十个孤 独症易感位点或基因，并在某些基因中发现了高致病效应的罕见突变。孤独症的遗传度在90%以上，但已发现的遗传因素只能够解释 10-20%的患者，因此孤独 症的遗传基础在很大程度上还没有阐明。 而且由于孤独症高度的表型异质性，针 对某种临床亚型或内表型的遗传基础也很

8、少有人探究。 本项目将利用全基因组关 联研究寻找孤独症的常见变异，通过全基因组CNVs扫描以及外显子捕获结合第 二代测序技术寻找孤独症的罕见致病变异。在临床实践和研究工作的基础上，依 据核心症状等临床亚型或内表型进行分组， 开展基于临床亚型或内表型的 GWAS 及第二代测序研究，鉴定孤独症易感基因。3、孤独症的分子发病机制研究：由于遗传基础不明，缺乏合适的细胞和动物模型，孤独症的分子病理机制研究还处于早期阶段。本项目将利用遗传学、细胞生物学、生物化学与分子生物学以及电生理等方法，对前期研究工作已发现的 和本项目新发现的部分易感基因开展研究， 鉴定孤独症的神经生物学基础。同时， 一方面建立患者来

9、源的iPSCs并诱导分化为神经元作为细胞模型，另一方面选择 几个高度相关的易感基因构建敲除、点突变敲入或过表达小鼠和果蝇模型，确定 这些细胞和动物模型中神经发育、神经元可塑性、突触连接功能、神经环路或行 为学变化，预测相关基因在神经发育、突触功能和神经环路中的作用，以阐明孤 独症的分子发病机制。止匕外，由于孤独症多基因遗传背景，单个基因变异可能无 法构建符合孤独症行为学特征的动物模型，本项目拟利用最新的染色体工程技 术，以发现的疾病相关CNVs为目标，探索构建孤独症的小鼠模型。4、孤独症的分子调控网络和风险预测模型的构建：孤独症的临床和遗传异质性说明多种病因（遗传、环境、表观遗传等）、多条生物

10、学通路参与了疾病发生过程，从系统水平研究孤独症的发病机制将是一个有效的方式。本项目将利用生物信息学技术构建一个数据整合平台，将各个课题组的研究结果以及公共数 据，包括环境数据、表型数据、影像学数据、基因组数据以及神经生物学数据等 进行整合，并利用数学建模的理论和方法，构建孤独症分子调控网络，寻找潜在 的生物学通路，结合转化医学建立孤独症风险预测模型，辅助孤独症的早期诊断 和预防。二、预期目标（一）总体目标通过临床实践和研究，发现部分孤独症的特征表型和内表型， 对孤独症进行 亚型分类，为制定符合国际标准，并具有神经电生理、影像学等特征的诊断体系 提供科学数据；利用细胞遗传学、分子遗传学和基因组学

11、技术，鉴定孤独症的易 感基因，阐明疾病发生、发展的遗传学基础；利用生物化学、细胞生物学、分子 生物学、电生理等技术，以及合适的细胞和动物模型，研究孤独症的神经生物学 基础，阐明孤独症的分子发病机制；利用染色体工程技术，探索构建多基因遗传 背景、符合孤独症行为学特征的动物模型，并应用于孤独症的发病机制和干预研 究；利用生物信息学技术和数学建模方法，整合孤独症有关的临床、遗传、神经 生物学等信息，构建孤独症分子调控网络，建立孤独症风险预测模型，为孤独症 的早期诊断、早期干预和临床治疗提供科学依据。（二）五年预期目标1 .建立一个10,000例样本以上的孤独症临床和遗传资源库， 将孤独症样本以社 交

12、障碍、语言障碍、刻板行为等核心症状为主细分临床亚型，并通过生化、 电生理、脑成像等方法鉴定几个孤独症的内表型。2 .联合应用经典细胞遗传学、全基因组 CNVs分析、GWAS以及第二代测序技 术，发现10-20个孤独症（或某些核心症状）的致病或易感基因。3 .选择若干已有的和本项目新发现的与疾病相关的易感基因，研究其生理功能及其参与的神经生物学过程，初步阐明孤独症的分子致病机制。4 .建立10-20个孤独症患者特异性iPSCs细胞模型并分化为神经元，在孤独症 患者遗传背景下研究发病机理，建立5-10个孤独症易感基因突变的动物模型 研究孤独症易感基因功能。5 .利用生物信息学技术整合大量样本的临床

13、数据、 影像学数据、基因组数据等， 寻找孤独症相关的生化通路和调控网络并构建一套孤独症网络分析预测模 型。6 .在国际权威杂志上发表 50篇以上的SCI专业论文，其中IF >10勺专业论 文8-10篇、IF >20的专业论文3-5篇。7 .培养一支创新团队和中青年学术带头人队伍， 确定我国在孤独症病因和发病 机制研究领域前沿的学术地位。8 .促进国内外孤独症研究的学术合作和研究资源的交流，以加强我国儿童发育性疾病的基础和临床研究。（三）项目总体目标和五年目标的关系项目总体目标是针对目前孤独症面临的现状，通过临床实践和研究，实现对孤独症的早期诊断、早期干预。在本项目中，经过五年的努力

14、，我们将发现部分 孤独症的特征表型和内表型，对孤独症进行亚型分类，为制定符合国际标准的诊 断体系提供科学数据；发现孤独症的部分遗传基础；阐明孤独症的部分分子发病 机制；构建动物模型，应用于孤独症的干预研究；构建孤独症分子调控网络，建 立孤独症风险预测模型。五年目标是实现总体目标的基础， 一方面可望鉴定孤独 症的主要遗传学基础，初步阐明疾病发生的遗传学机制和分子病理机制，从而为 全面认识其发病机理研究提供思路，为后续开展干预和治疗研究提供有效的细胞 和动物模型；另一方面，获得的数据及构建的分子网络将为实现孤独症的早期诊 断和早期干预提供重要的科学思路和依据。三、研究方案（一）学术思路和技术途径通

15、过临床特征表型、电生理和脑影像学研究等鉴定孤独症内表型， 进行亚型 分类；在内表型和临床亚型分类及前期研究工作的基础上，利用细胞遗传学、分子遗传学、基因组学及第二代测序技术，鉴定孤独症的易感基因，阐明疾病发生、 发展的遗传学基础；以培养神经元、患者来源的iPSCs诱导神经元及易感基因动 物模型，综合利用生物化学、细胞生物学、分子生物学、电生理、行为学等技术， 研究孤独症的神经生物学基础，阐明其分子发病机制；采用染色体工程技术，构 建多基因遗传背景的孤独症动物模型；整合孤独症有关的临床、遗传、神经生物 学等信息，构建孤独症分子调控网络及风险预测模型， 为孤独症的早期诊断、早 期干预和临床治疗提供

16、科学依据。本项目研究内容总体目标常见变舁鉴定已知的利前删研究发现的易感甚因细胞和动物模甲T + TS +!孤独症患者，家系临床表型，影像学等内灵型要定分加独症易购风因-fc-i E + * + + 笄见变异鉴定 检型，匚田箝时争分子致疝机制研究神戳生他闫生曲在建亨2图2总体技术途径（二）创新点与特色1 .临床与基础的结合：国际上孤独症研究的样本多为ASD患者，具有高度临床异质性，给基础研究工作带来很大困难。鉴定孤独症不同临床亚型的分类， 消除样本表型异质性给基础研究工作， 尤其是给遗传学研究带来的影响极其 重要。本项目设置了一个有较强临床研究基础的课题组，通过临床表型、影 像学等技术对遗传资源

17、进行详细的临床亚型及内表型分类，进一步以特异的内表型对样本分组，由于分组患者有较高的同质性，有利于鉴定在孤独症发 生中起重要生物学意义的易感基因。2 .学术理论的创新：本项目中我们提出的科学假说是“ 孤独症具有明显的遗传 易感性，与其相关的遗传基础主要分为两类：一类是以 SNPs等常见变异为 代表的潜在背景基因，另一类是以染色体异常，新发CNVs和罕见基因突变 等为代表的主效基因。两类基因是疾病发生共同的遗传基础， 并且在环境因 素以及表观遗传异常的作用下造成神经发育，神经元可塑性，突出连接功能和神经环路异常，最终导致孤独症表型的出现此假说是根据目前孤独症的研究现状提出的，具体依据包括：（1）

18、已鉴定的易感位点或基因众多，但 很少被重复验证；（2）近年的研究发现孤独症患者约 3%携带染色体异常， 约5%存在相关CNVs,提示在异常染色体和CNVs累及的区间存在与孤独症 直接相关的易感基因；（3）罕见变异导致子代患病，但携带相同变异的父亲 或母亲正常；（4）所有易感位点或基因加起来也只能够解释大约10-20%的患者。基于上述原因，我们认为孤独症的遗传基础与多数复杂疾病相比，存 在一定程度的差异，除了通过关联研究发现的背景基因之外，可能有潜在的 罕见主效基因，二者协同作用导致疾病的发生。3 .新技术的应用：目前复杂疾病的研究已经进入一个高通量的时代，本项目将 利用新一代高密度基因芯片进行

19、全基因组关联研究和CNVs分析，利用新一代测序技术进行全外显子组测序，寻找孤独症新的罕见或新发致病突变，从 基因组学水平系统研究孤独症的遗传病因。4 .孤独症患者来源的iPSCs的建立：由于孤独症的多基因遗传背景，根据单个 基因变异构建的细胞或动物模型很难模拟真正的孤独症表型。我们将利用患者来源的细胞构建具有孤独症遗传背景的iPSCs并定向诱导分化为神经元， 以此细胞模型来研究孤独症的分子发病机制。5 .利用染色体工程探索构建孤独症动物模型：孤独症发病机制以及潜在的治疗靶点的探索需要有效的动物模型，通用的动物模型仅涉及单个基因或2-3个基因，与孤独症的遗传基础不符。本项目在开展单个基因有关的动

20、物模型研 究同时，将利用最新的染色体工程技术，探索构建孤独症的多基因连锁群遗 传背景（如疾病相关的CNVs）的动物模型，并对模型进行行为学评估。（三）可行性分析1、坚实的前期研究基础研究团队具有丰富的临床诊疗经验并且已经诊治孤独症谱系障碍儿童约 20000例，收集了近5000例孤独症样本。通过前期研究，已在全基因组学关联 研究，外显子测序和易感基因的神经生物学研究积累了一定经验，为本研究的 立项积累了坚实的遗传基础研究和大量的基因组数据。其全基因关联研究和外 显子测序在国内尚属于首例。本研究临床和遗传资源依托的中南大学精神卫生研究所、中山大学第三附属医院儿童发育行为中心、南京医科大学附属脑科医

21、院儿童心理卫生研究中心、哈尔滨医科大学以及中南大学医学遗传学国家重点实验室在孤独症临床诊治、资源收集、保存和利用方面做了大量的工作。南京医科大学附属脑科医院儿童心理卫 生研究中心是我国最早报道孤独症的单位，自1991年起一直从事孤独症的临床诊治工作，已收集孤独症核心家系 200多个；中山大学附属第三医院近10年来 也一直致力于孤独症的临床诊疗工作， 积累了孤独症病例10000例以上，均有详 细的临床资料及评估体系，收集了 400个孤独症家系的临床资料及 DNA样本（包 括患儿与一级亲属）。哈尔滨医科大学 2007年初开始建立孤独症核心家系生物 样本库，目前已收集600个孤独症核心家系样本。中南

22、大学精神卫生研究所和医 学遗传学国家重点实验室近几年来也致力于孤独症的临床和基础研究，共收集孤独症临床和DNA样本1676例，其中核心家系460个。这些资源充分保证了本 项目对样本数量的要求。本项目建议首席科学家夏昆教授和赵靖平教授合作，利用Illumina高通量芯片与成国内第一个孤独疝全基因组关联研究（ GWAS）和拷贝数变异（CNVs）研究。本项目组前期利用收集的部分遗传资源进行了GWAS和CNVs分析。GWAS研究的初筛结果见图3。通过国际合作，在676个来源于AGRE的高加 索人群孤独症核心家系中验证，发现了 4个具有全基因组显著相关位点(p<5e-07),目前文章正在Natur

23、e杂志审稿。所发现的4个基因均位于以前的 两个连锁研究定位的区域内，其中两个基因属于被认为对孤独症有重要作用的 mTOR/PI3K通路。这为我们开展神经生物学研究，探讨孤独症发病机制提供了 可靠的科学基础。与此同时，发现了两个基因位点接近全基因组显著水平，与最近 JAMA和 Nat Genet报道与神经发育疾病和阿尔兹海默病有关的基因相同。利用先进的全基因组关联分析技术，我们的孤独症全基因组关联研究发现多个常见变异与孤 独症相关，打破西方一些人认为 CNVs是孤独症的主要遗传因素。通过本项目 研究，我们将进一步加大样本量，以发现更多的易感基因。止匕外，全基因组CNVs 分析也得到了大量的有意义

24、的结果， 在验证已发现的CNVs位点的同时，发现了 多个新发的和遗传的罕见 CNVs,这些CNVs所包含的基因将成为我们接下来要 重点研究的对象。图3全基因关联分析，统计分析结果按染色体绘图中国科学院孙中生研究员前期开展的外显子组捕获结合第二代高通量测序 研究，为在全基因组关联的基础上寻找功能变异( causal variants积累了经验。 前期研究中我们已经用外显子组捕获结合第二代测序技术对20个白人样品和10个独立的中国人孤独症病例进行了遗传突变的筛查，并且在更大的孤独症样本中对结果进行了验证。发现了一个新的孤独症致病基因，目前文章正在Nat Genet杂志审稿。这一成果的完成不仅发现了

25、孤独症新发突变易感基因，而且还证明了运用第二代测序技术在孤独症遗传学研究中的作用，为本项目开展的研究工作开辟了新的思路，积累了宝贵经验。本项目研究人员具有丰富的孤独症易感基因神经生物学研究经验。东南大学发育与疾病相关基因”教育部重点实验室在国际上最早克隆了果蝇的 dneuroligin (dnl)和 dneurexin (dnrx)基因并发现它们与人类的Neuroligin 和Neurexin有高度的同源性。对这两个基因的前期研究发现dnrx基因突变的幼虫有严重的运动缺陷，脑神经元突触数目减少，并且突触小泡分布也发生了明显的 改变，幼虫和成虫的联想式嗅觉学习记忆被打断(Zeng, 2007),

26、 DNRX参与突触囊泡再循环(Sun, 2009), dnl2突变体的 NMJ中，DGluRIIA 的募集量增加， DGluRIIB和DGluRIII的募集量减少；突触前活跃区的标记物Brp的spots的数量增多，突触后PSD的标记物D-PAK的cluster的面积明显变小，DNRX与DNL2 相互作用，参与突触分化和突触成熟(Sun, 2011)。小鼠神经细胞培养体系中的初步研究显示，在代谢型谷氨酸能受体依赖的长时程抑制(mGluR-LTD)的情况下，Neuroligin的突触表达受到神经活动的动态调控(未发表资料)，提示在mGluR-LTD情况下，Neuroligins和Neurexins

27、跨突触相互作用对协调突触前、 后 改变有至关重要的作用。该研究可能为理解长时程突触可塑性的分子机制提供崭 新的视野，为阐明孤独症的神经生物学机制奠定前期基础。2、完善的技术平台和雄厚的科研实力中南大学医学遗传学国家重点实验室、中国科学院北京生命科学研究院和中 国医学科学研究院具有整套先进的医学遗传学研究技术平台，包括IlluminaBeadArray高通量基因分型系统，HiSeq2000第二代高通量测序仪和 Sun高性能 计算机系统等设备和相应的技术支持。研究团队在细胞遗传学、分子遗传学、表观遗传学、基因功能组学等方面做出了显著成绩，相关研究总计发表论文600余篇，部分论文发表在 Nat Ge

28、net, J Clin Invest, PNAS等国际一流杂志。中南大学精神卫生研究所是我国四大精神卫生区域中心之一，学科现有6个国内一流各具特色的研究方向，分别是临床心理评估、精神应激、成瘾行为、 精神药理与生物精神病学、儿童精神病与精神卫生、精神疾病脑影像与脑电生理诊断研究方向。在神经精神性疾病的临床研究方面有雄厚的基础和实力。在JAMA, Am J Psychiatry, Mol Psychiatr等国际一流杂志发表论文多篇。东南大学发育与疾病相关基因”教育部重点实验室和中南大学医学遗传学 国家重点实验室建成了以小鼠、 果蝇、线虫等模式生物基因修饰的共用平台，拥有分子和细胞神经生物学、神

29、经生理学、神经药理学、分子影像学和基因敲除/转基因设施以及SPF级小鼠饲养中心等实验软硬件条件，还具有包括2台大型电子显微镜、7.0T MRI动物专用 micro-MRI、2台单光子激光共聚焦显微镜 (Zeiss, Olympus),活细胞工作站(Time Lapse Microscope, Zeiss),倒置荧光显微 镜、正置荧光显微镜、体视荧光显微镜、双光子激光共聚焦显微-电生理分析系统、4套电生理记录系统(含双通道膜片钳记录系统)、莱卡 UC6新型超薄切 片机、动物行为学检测系统、脑片 LTP记录系统。这些实验平台和大型仪器设 备等将成为本973项目重要的支持力量，充分保证本项目的顺利实

30、施。电子科技大学神经信息教育部重点实验室是三期985重点建设实验室。2011年学校已立项2500万建设以磁共振成像3.0T为平台的脑研究中心，目前有3套 128道脑电采集系统和电生理采集系统。30台4核和8M, 1.5T硬盘的高档计算 机分析系统，目前已在神经精神疾病脑影像研究中取得了重要研究成果，发表 50余篇高水平SCI论文，可以满足数据采集和分析的需要。为孤独症脑成像的 内表型研究提供了有力条件。上海生物信息技术研究中心已经建立了可操作的生物信息资源汇交平台和 基因组功能注释、生物芯片数据分析、蛋白质组数据分析技术平台。还建立了人 类疾病相关基因的高通量生物信息学筛选技术体系，拥有旧M、

31、SUN、SGI等大型服务器9台，PC集群三套，总CPU个数超过200个，存储容量超过40TB。 保证了本项目的生物信息学的软件和硬件需求。（四）课题设置围绕本项目拟解决的关键科学问题,如下图：我们共设置了 5个课题，课题设置思路课题二；孤独症临床亚型厂内表至及影像学研究课题三孤独症居神经生物学及分子致病机制研究科学问题一课题二：孤独症的遗传基础研究谡甄四；易感基因模式生物的建立 和研究便翘五：孤独症的分子调控网络和预测模型的构建图4课题设置思路图课题1：孤独症临床亚型、内表型及影像学研究研究目标：前期研究中，我们已经收集了近 5000例孤独症临床资料及DNA样本，其 中家系1500多个（患儿及

32、一级亲属）。前期研究已发现孤独症广泛表型中的某 些特定表型符合可遗传性、家族聚集性及与疾病状态相对独立性等候选内表型的 条件，课题组完成了孤独症患儿神经认知、 功能影像学等预实验项目。本课题的 主要研究目标是：1、收集孤独症家系及其血样标本，完善病例的诊断评估，以 及家系成员的神经心理学指标、脑影像学指标、神经电生理指标及相应的生化、 代谢指标等数量性状的测量，建立中国儿童孤独症临床，环境和遗传资源库；2、 全面筛选具有可遗传性、家族聚集性、共分离以及疾病状态相对独立性的候选内 表型，并进行内表型分组研究；3、通过与本项目其他课题组的合作寻找不同内 表型的遗传学基础和致病机制，并探索内表型在孤

33、独症临床中的早期预警及早期 预防作用。研究内容1、建立中国儿童孤独症临床、环境和遗传资源库(1)各参加单位协作，按照统一标准共同收集符合孤独症诊断访谈量表修 订版(ADI-R )诊断标准的孤独症家系5000例，对患儿进行社交反应量表(SRS) 及心理教育量表修订版(PEP-R)评估，并对一级亲属进行孤独症广泛表型评估。(2)采用自编访谈表和一些代表性的量表收集患儿在胎儿时期及出生后的 环境因素数据，分类整理，登记入册。(3)在知情同意的原则下，采集患者及其父母的外周血，抽提 DNA并建 永生细胞株。(4)根据患者样本的性别组成、年龄层次，随机选取3岁以上的正常人作为对照样本，采集外周血，抽取

34、DNA。2、鉴定孤独症的内表型(1)对患儿及其一级亲属进行神经认知测试，包括威斯康辛卡片分类任务(WCST),韦氏记忆量表修订版(WMS-R),韦氏智力量表(WPPSI/WISC/WAIS ) 等，收集神经认知的数量性状数据。(2)对患儿进行脑影像学指标(包括结构和功能影像学指标)、神经电生 理指标(如：听觉诱发电位，事件相关电位，脑电图)及相应的生化、代谢指标 等进行鉴定，收集相应的数量性状数据。(3)根据数量性状与不同神经信号通路和神经网络通路的联系，采用表型 - 内表型建模的多重变量统计分析策略筛选候选内表型，并在其他神经精神疾病及普通人群中测量这些内表型在不同群体中的分布，建立孤独症候

35、选内表型数据 库，并对孤独症进行内表型分类。3、对孤独症的临床亚型进行分类综合表型评估的数据和已鉴定的内表型， 对孤独症进行临床亚型分类，将孤 独症细分为社交障碍、语言障碍、刻板行为等更多的临床亚型，以指导临床诊断 和其他基础研究工作特别是孤独症的遗传病因学研究(课题二)。对资源库中已明确临床亚型和内表型的样本，与本项目课题二和课题三合 作，鉴定不同内表型和临床亚型潜在的遗传基础以及不同遗传背景下的致病机 制，为孤独症针对性干预和治疗提供依据。经费比例：20%承担单位： 中南大学、中山大学、电子科技大学、南京医科大学、哈尔滨医科大学课题负责人：赵靖平学术骨干：邹小兵、陈华富、柯晓燕、曾翎、武丽

36、杰课题2:孤独症的遗传基础研究研究目标：我们的研究假设认为易感遗传背景（常见变异）和某些基因的罕见或新发突 变共同构成了孤独症的遗传学基础。 针对这一假说，我们将结合课题一建立的资 源库研究孤独症遗传学基础。本课题中我们主要有三个目标：1、利用经典细胞遗传学，全基因组CNVs扫描和第二代高通量测序技术等方法鉴定孤独症 （或某 些核心症状、特征表型）的罕见和新发变异。2、利用新一代高通量基因分型技术结合临床研究工作，对孤独症患者（或某些核心症状、特征表型）进行全基因 组关联研究，寻找孤独症易感遗传背景（常见变异）。3、与课题三和课题四合作，在细胞和动物模型中鉴定我们发现的孤独症易感基因所参与的神

37、经生物学过 程，特别是它们如何参与神经元的发育、突触功能和神经环路等异常。这一研究 将从系统水平上去阐明孤独症的遗传病因，并初步阐明孤独症遗传背景下的神经 生物学机制。研究内容1、罕见或新发变异的鉴定（1）对本项目新收集的孤独症患者采用高分辨染色体显带技术进行核型分 析，寻找与孤独症相关的染色体异常。（2）采用高通量的基因分型芯片对孤独症DNA样本和对照样本进行全基因组基因分型，并分别用 PennCNV和QuantiSNP对患者和对照样本的分型数据 进行全基因组CNVs分析。关注：在患者和对照中存在显著差异的 CNVs； 仅在患者中出现而在对照中没有出现的 CNVs；分析该CNVs是父母遗传还

38、是新 发（de novo）;与数据库比较，排除数据库中常见的、可能为多态的CNVs；与已有孤独症遗传变异数据库比较，分类已报道的CNVs和我们新发现的孤独 症特异性CNVs。（3）对相关的异常染色体和某些可能打断基因的 CNVs,进一步通过基因 组BAC克隆FISH、高密度基因芯片、长片段 PCR等不同技术鉴定染色体断裂 重接位点，确定DNA分子结构的改变，分析发生断裂的基因、产生的融合基因、 缺失或重复的基因，以备候选。(4)将上述候选基因在大样本量的孤独症患者和对照人群中采用经典的 Sanger测序的方法对全部外显子和剪接位点进行重测序，以期发现高致病效应的 罕见或新发突变，确定孤独症易感

39、基因。(5)与课题一合作，针对 2-3种确定的内表型，每一种内表型选取20-30个样本，利用Illumina第二代高通量测序技术和 Agilent液相外显子捕获系统进 行全外显子组测序。寻找引起孤独症特定内表型的易感基因。2、孤独症常见变异研究(1)选择已收集孤独症资源库中的样本进行两种全基因组关联研究(GWAS)设计：1)核心家系的传递不平衡检验；2)病例-对照关联分析。利 用Illumina新一代的高通量基因分型芯片对这两组样本进行基因分型。(2)利用Plink等全基因组关联分析研究工具对核心家系和病例对照的基 因型数据进行全基因关联分析研究。中国人群核心家系和病例对照作为初筛数 据，在大

40、样本量的高加索人群中进行验证，寻找孤独症易感区间。(3)综合临床亚型和内表型信息，将不同临床亚型和内表型的孤独症样本 进行分类，减小临床和遗传异质性，再进行全基因组关联分析。寻找特定内表型 下的常见变异。(4)对显著关联的易感区间，利用千人基因组计划数据，通过 Imputation 的方法对已鉴定的区间进行精细定位，寻找真正致病(Causal)的变异。3、研究易感基因的神经生物学功能与课题三和课题四合作，将本课题组鉴定的孤独症易感基因在细胞和动物模 型中研究其在神经元发育、突触功能和神经环路中的作用，阐明这些基因参与的 神经生物学基础。经费比例：25%承担单位：中南大学、中国科学院、中国医学科

41、学院课题负责人：夏昆学术骨干：孙中生、张风雨、孙玉慧、薛红、江泓研究目标：目前国内外研究表明，孤独症与其它脑疾病一样，也是神经发育异常而导致 突触功能及神经环路异常的疾病，目前所发现的和推测的易感基因的蛋白质产物 主要分布在神经元和突触部位。本课题主要有四个研究目标：1、针对课题二（孤 独症的遗传基础研究）所发现的候选基因，从分子、细胞和整体等不同层次深入 研究这些孤独症易感基因的表达、修饰、转运和分布及其调节机制；2、上述基因在神经元分化、突触发生和可塑性中的作用及其机制的离体研究；3、上述基因和已知孤独症候选基因的关联及机制；4、上述基因在小鼠神经环路及突触中的功能及机制的在体研究。研究内

42、容1、基因的选择、表达定位和定向转运与机制对已知及课题二中已发现的基因（如 ANK等）和可能找到的新候选基因及 其突变体进行筛选，选择3-5个和脑活动，特别是可能与孤独症核心症状有关的 基因（例如与社交及认知障碍紧密关联），应用多种技术（如抗体制备，免疫标 记，荧光蛋白GFP, YFP, mRFP, CFP融合，转染神经细胞，制备转基因果蝇， 双光子激光共聚焦实时动态分析等），对有关基因表达的脑区域、细胞类型及超 微分布及调节进行详细分析。我们将以小鼠（包括大脑皮层，海马区域CA1突触等）和具有脊椎动物中枢神经系统突触特征的果蝇神经肌肉接头（NMJ）作为主要研究模型，对有关基因在神经系统的表达

43、规律、 突触定位特征以及定向转运 与机制进行深入研究。2、候选基因在神经元分化、突触发生和可塑性中的作用及其机制鉴于目前发现的孤独症相关基因（如 neurexin和neuroligin等）产物主要在 神经元和突触分布，我们将对上述发现的有关基因在神经元及突触中的功能及机 制进行分析。通过 Gain-of-function和Loss-of-function途径，分析这些基因过量 表达和缺失突变体对果蝇NMJ中电生理的变化及突触前、后结构与功能的影响； 以转染神经细胞等方法（如shRNA及病毒表达）对有关基因和突变体对小鼠神 经元细胞的分化、数量，形态（树突、轴突、spines5种类（兴奋性，抑制

44、性）,突触形成和突触功能的可塑性（如 LTP和LTD）的影响进行系统分析。其中， 我们将特别着重应用双光子激光共聚焦一电生理分析系统，实时动态分析突触及 亚突触结构与功能变化的特征。这些分析将共同阐明有关基因在突触发生、成熟 及可塑性中的作用。3、本项目筛选到的候选基因与已报道孤独症相关基因的关联研究在已经建立的孤独症相关基因（如 dnrx和dnl）研究成果的基础上，以酵母 双杂交，免疫共沉淀、果蝇遗传筛选及其它方法，对本项目筛选到的候选基因与 已报道的孤独症相关基因相互作用进行分析。应用Neurexin和Neuroligin C段胞 内区和N段胞外端为诱饵进行酉母双杂交及体外 PULL-DO

45、WN证明所分析的基 因产物是否存在直接相互作用；应用果蝇遗传学筛选技术，筛选（和/或验证）遗传上相互作用的上、下位效应基因。不仅针对经典的NMJ结构，还对包括中枢神经系统（mushroom body）等其它突触结构进行平行研究。同时探讨 miRNA（如miRNA-92b , miRNA-124等）对突触形成的调控与功能的影响。4、孤独症易感基因的动物模型和神经生物学功能及机制的在体（in vivo）研究利用课题四制备的动物模型，结合病人数据（课题一、二）及动物行为研究（课题四）进行一系列在体研究，其中包括：（1）用常规染色及MRI等脑成像技术，系统分析脑体积，形态结构及脑亚区大小形态结构，我们

46、将特别关注那些 在孤独症患儿有关变化的脑区域；（2）选择有变化的脑区域（如脑皮层，海马及 纹状体），采用在体染色（Golgi staining）、活体细胞荧光跟踪和 EM等枝术，详 细分析神经元的数目、种类（兴奋性，抑制性）、树突、轴突复杂程度及走向，突 触数目、种类等；（3）采用fMRI、整体动物电生理、双光子共聚焦成像等枝术， 检测分析有关脑区的神经环路突触功能（例如CA3-CA1、Cortical-Striatum环路 突触）及可塑性（例如EPSPs LTP、LTD、spine形态可塑性等）；（4）用生化、 分子生物学、功能拯救 （rescue）等技术、检测以上动物模型有关脑区神经环路

47、中的分子及生化信息传递变化，并证实其在神经元及突触形态和功能异常中的 作用；（5）结合动物行为研究结果，特别在学习记忆、社交等核心症状方面，对 其动物模型在分子、突触、细胞、环路各层次进行相关分析。揭示有关基因及突 变体在神经元发育环路的形成和功能中的作用及机理。这些结果将为鉴定及阐明孤独症的神经环路和突触机理提供不可缺少的证据。经费比例：25%承担单位： 东南大学、重庆医科大学、中国人民解放军总医院课题负责人：谢维学术骨干：加正平、周卫辉、袁榴娣、邹丽萍、黄璐平、董志芳课题4:易感基因模式生物的建立和研究研究目标目前为止，文献报道的孤独症细胞和动物模型很少， 而且由于孤独症的病因 异质性和多

48、基因遗传背景，这些动物模型一般不能显示出孤独症症状。在这一课 题中，我们白目标是：1、利用诱导多潜能干细胞（iPSCs）技术，制备带有孤独 症患者遗传背景的特异性iPSCs,并定向诱导分化为神经元，用于研究孤独症的 发病机制；2、制备和使用易感基因变异的动物模型，研究特定基因的神经生物 学功能，如对神经元可塑性、突触连接功能和神经环路的影响；3、利用最新的染色体工程技术探索构建多基因遗传背景的孤独症动物模型。研究内容1、孤独症患者来源的诱导多潜能干细胞（iPSCs）建立和应用由于孤独症的病因不完全清楚,至今尚没有可以完全模拟孤独症的动物模 型。动物的遗传背景与人类有较大的差别可能是其中重要的原

49、因之一。因此，我们将建立一批孤独症患者特异的诱导多潜能干细胞（iPSCs）,包括CNVs变异 和孤独症相关基因突变病例的iPSCso这些细胞将携带孤独症患者的所有遗传信 息。由这些细胞分化的神经元将会较容易模拟孤独症发生的病理过程。我们将利用这些细胞来研究孤独症相关的神经突触形成以及电生理活动的异常。2、孤独症易感基因的小鼠和果蝇模型建立制备多种孤独症相关研究的模型，根据项目组成员的最新研究进展，我们将 选择新发现的5-10个易感基因构建敲除、点突变敲入或过表达转基因的小鼠和 果蝇模型。这些动物模型一方面用于课题三中的基因功能研究，为在整体动物层面阐明这些基因在孤独症病理改变中的作用提供小鼠和

50、果蝇模型。另一方面，我们将利用这些动物模型进行一系列的行为学研究，以期阐明这些基因的改变与孤 独症相关行为的关系。3、用染色体工程探索构建多基因遗传背景的孤独症动物模型许多证据都表明CNVs是孤独症发病的一个重要遗传因素。本课题拟利用染 色体工程技术改造与人CNVs相对应的小鼠染色体区域（重复、缺失、倒置等）， 建立最大程度上模拟人类孤独症的动物模型。这些动物模型一方面将用于课题三 的神经生物学研究，为在整体动物层面阐明这些 CNVs改变在孤独症病理改变中 的作用提供小鼠模型。另一方面，我们将利用这些动物模型进行一系列的行为学 的研究，以期阐明这些CNVs的改变对孤独症相关行为的影响。4、行为

51、学研究孤独症主要的评价指标是行为学，为了更好地研究基因、染色体改造的小鼠 与孤独症的关系，我们将开展一系列与孤独症相关的行为学检测，包括：社会行为、学习记忆、焦虑、抑郁、生物节律、痛觉、视觉、嗅觉、听觉、运动协调能 力、癫痫倾向性等。如果我们可以得到在行为学上较好模拟人类孤独症的模型， 我们将利用这些模型进行一些干预研究。5、脑功能网络分析鉴于孤独症儿童有明显的脑功能网络异常， 利用东南大学7T动物fMRI,分 析上述所建立的所有模型小鼠，与课题三、课题五结合，分析这些基因对脑功能 网络的影响，并结合行为学、电生理分析和突触连接形态分析， 从多层次理解孤 独症的发病机理。经费比例：20%承担单

52、位：中南大学、东南大学、中国科学院课题负责人：李家大学术骨干：方明、姜永辉、许执恒、禹顺英、陈晓岗课题5:孤独症的分子调控网络和预测模型的构建研究目标：本课题旨在整合大量样本的临床数据、影像学数据、SNPs、CNVs和神经生物学的实验数据，构建数据收集管理平台；并根据不同组学水平的数据构建表征 孤独症全基因组调控关系的生物网络， 找出重要的SNPs、CNVs,从全基因组水 平揭示疾病发生发展过程。本课题主要有三个研究目标：1、构建一个数据管理系统，整合现有的疾病临床数据、影像学数据、基因组数据和神经生物学实验结 果，并支持数据的更新和扩充；2、整合现有的孤独症的各种层次的数据，以生 物学网络分

53、析技术为核心，构建孤独症相关生物学网络；3、发现一批新的孤独症易感风险预测标记因子、早期诊断标记物、治疗药物靶标，提出有助于临床推 广的疾病发病预测模型。研究内容1、建立孤独症的科研电子病历数据库、临床实验数据库和遗传数据库，建立全 面整合的数据管理和信息交流平台。2、利用公开的孤独症相关数据库，以全连接网络为出发点，整合公共数据和本 项目所产生的数据，计算出任意两个基因之间的相似性、表征边存在的可能性， 然后综合这些数据，构建孤独症全基因组调控关系的生物网络。3、将SNPs、CNVs数据作为自变量，转录调控网络作为因变量，通过多元线性 回归的方法找出自变量和因变量间的关系，建立SNPs、CN

54、Vs的调控网络。4、整合上述网络成系统水平上的网络，针对不同内外表型，验证和调整网络。5、进一步分析所构建的网络，寻找网络中存在的中心节点（ Hub）和子模块， 通过和临床表型的相关性分析，预测孤独症发病机制。6、发展新的高通量分析技术，通过基于模块相似性比较的算法，构建一套高效 预测孤独症发病情况的数学模型，为临床已诊断的孤独症提供分子理论依据， 确 定孤独症相关联的内外表型和它的细化区分。7、完善数据收集整理系统，通过不断更新数据，进一步提高预测模型的准确性， 提供其它课题所需的分析和技术支持。8、和课题三、课题四合作，利用东南大学 7T动物fMRI ,分析小鼠模型中的易感基因变化与脑功能

55、网络的变化规律。经费比例：10%承担单位： 上海生物信息技术研究中心、北京大学、中山大学课题负责人：郝沛学术骨干：钟南、王学钦、鱼勇涛、王靖方（五）各课题间的相互关系如下:课题一为课题二提供样本；开展临床亚型分类，指导课题二的遗传学基础 研究。收集的临床信息汇集到课题五进行分子网络和风险预测模型构建。课题二发现的易感基因用于课题三分子致病机制研究和课题四动物模型构 建。产生的基因组数据汇集到课题五进行分子网络和预测模型构建。课题三研究结果汇集到课题五进行分子网络和预测模型构建。分子机制研 究结果提示的孤独症相关神经生物学通路和易感基因，进一步由课题二进行突变 筛查或关联研究。课题四为课题三提供

56、细胞和动物模型，同时利用这些动物模型进行行为学 研究，研究结果汇集到课题五进行分子网络和预测模型构建。课题五广泛收集其他课题的数据，结合公共数据构建孤独症的分子网络和 风险预测模型。课题五所构建的分子调控网络可能提示新的相关基因，由课题二开展遗传相关性研究、课题三进行分子机制研究。各课题间关系如下图：c课题五”课题三j 分子网明构建/回控分子 工博经生物学y" 信号通路 、-图5课题间关系示意图四、年度计划研究内容1、制订新收病例所需的临床资料 记录表、操作手册、各种诊断测 试工具，并完成孤独症诊断访谈 量表修订版（ADI-R）、其他相关 的测试和记录工具的使用培训 和一致性检测。建

57、立统一的脑影 像学、神经电生理学、及相应生 化和代谢测量的技术指标。2、按要求试收集病例，并进行质量 检测。根据已有的5000例孤独 症临床资料和基因分析结果，结 合国内外相关文献，初步筛选出 孤独症候选的内表型。3、对孤独症患者采用高分辨染色 体显带技术进行核型分析，寻找 孤独症相关的染色体异常。对患 者和对照样本采用高通量基因 分型技术进行全基因组 CNVs分 析，筛查中国人群中孤独症关联 的拷贝数变异，确定孤独症的易 感拷贝数变异。针对特定的孤独 症表型，利用新一代高通量测序 技术和外显子捕获技术进行全 外显子组测序，寻找引起孤独症 特定表型的易感基因。4、分析孤独症已报道的易感基因（如 NRX NLG 过量表达或缺 失的果蝇品系，了解其在突触形 成及信号传递中的作用；筛选其 可能相互作用的分子。分析项目 研究新发现的孤独症易感基因 （如ANK3没其产物在小鼠神经 系统中的分布。利用生物芯片及 荧光报告基因系统筛选调控突 触发育的miRNAs5、构建本项