抗肿瘤药效学指导原则

1、抗肿瘤药物药效学指导原则(讨论稿)1 基本原则抗肿瘤药物可分为：(1)细胞毒类药物(cytotoxic age nt)：包括干扰核酸和蛋 白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等；(2)生物反应调节剂(biological response modifier)； (3) 肿瘤耐药逆转剂 (resistanee reversal agen； (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer) ； (5)肿瘤血管生成 抑制剂(tumor an gioge nesis in hibitor)； (6) 分化诱导剂(differe ntiati on in duci ng

2、age nt) ； (7)生长因 子抑制剂(growth factor inhibitor) ； (8)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide等。 抗肿瘤药物的药效学包括体内外抗肿瘤试验，评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。2 体外抗肿瘤活性试验2.1试验目的(1)对候选化合物进行初步筛选；(2) 了解候选化合物的抗瘤谱； 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。2.2试验方法 选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的和所选用的方法选择相 应的细胞系及适量的细胞

3、接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮 唑盐3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT还原法、 XTT2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulpho nyl)-5-carboxa nilide-2H-tetrazolium hydroxide还原法、磺酰罗丹明 B(sulforhodamine B,SRB)染色法、或51Cr释放试 验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。药物与细胞共培养的时间一般为48-72小时，贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性

4、 对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照。2.3评价标准以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应 曲线，然后采用Logit法计算半数有效浓度(IC50值或EC50值)。体外试验至少重 复一次。3 体内抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验结果是评价候选抗肿瘤化合物有效性的最重要指标。体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植瘤模型 或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定 该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。鼓励使用人癌裸小鼠移植瘤模型和多 种类的移植瘤模型，以较正确和全面地评价候选化合物的抗瘤活性和抗瘤谱。鼓 励使用原位接种

5、模型和中空纤维测定（hollow-fiber assay等先进的抗肿瘤作用评 价方法。3.1动物 动物要求健康，符合等级动物要求，有实验动物合格证。 雌雄均可， 但同一批实验中动物性别必须相同。 小鼠鼠龄为5-6周，体重为18-22克。评价 同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠。3.2 肿瘤模型3.2.1小鼠肿瘤模型可应用的小鼠肿瘤模型包括淋巴细胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宫颈癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤 B16、 网织细胞瘤M5076、肠癌26、肠腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、 肉瘤-180等，以及以上各种小鼠

6、肿瘤的亚型和耐药瘤等。3.2.2人癌裸小鼠移植瘤模型应选用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌移植瘤试验。模型的建立和使用请注意以下几点：（1）移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感 性应予了解。（2）移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。（3）对模型生长情况应全面了解，尤其是生长快的模型。（4）为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少15-20 代。3.3 试验过程3.3.1 接种 肿瘤接种方法主要有皮下接种、腹腔接种和原位接种。皮下瘤模型：选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死， 在无菌条件下（超净台或接种罩），用碘酒、酒精

7、或新洁尔灭消毒动物皮肤，切 开皮肤，剥离肿瘤。将瘤组织剪成1.5 mm3左右，用套管针接种于动物一侧或双 侧腋窝皮下；或制成细胞悬液，然后按一定比例加入无菌生理盐水，一般每只小鼠接种肿瘤细胞数量为（1-5）x 106。腹水瘤模型：无菌条件下，消毒动物皮肤，吸取生长良好的动物腹水， 以生理盐水按一定比例稀释后接种于动物腹腔，接种细胞数量一般为（1-5）x106。原位接种模型：原位接种是指将来源于某脏器的肿瘤接种在动物的某脏 器，如将人肝癌接种在裸小鼠的肝脏。原位接种不是常规的方法，但有其优越性， 是鼓励使用的方法。主要有肺、肝、胃、肠、乳腺、颅内等原位接种方法。3.3.2 分组和剂量设置分组：试

8、验分阴性对照组、阳性对照组、治疗组。治疗组设高、中、低 三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组， 裸小鼠移植瘤用游 标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至 100300mm3后将动物随机分组。治疗 组动物数普通小鼠每组至少10只，裸小鼠至少6只。阴性对照组动物数为治疗 组动物数试验组数。剂量设置：治疗组设高、中、低剂量治疗组，一般按4:2:1设置，高剂量使用最大耐受量或LDio的剂量。阴性对照组给予相应的溶剂；阳性对照药选 用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物，如试验化合物为一抗癌药物的衍生 物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性对照药。阳性对照药选择原则为：（1）疗效确切；（2

9、）与被试物质化学结构类似；（3）与被试物质有类似的作用 机理。3.3.3药物配制，给药时间和给药途径药物配制：溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解 者，可先用小量酸（0.1-0.5N HCI）或碱（NaHC03、NazCOs、NaOH）溶解，调节pH 在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温 80、DMSO助溶的药物，或用吐温 60、吐温80、2-3%淀粉、0.5%羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或 口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口 服、皮下或肌肉注射。给药时间和给药途径：分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学 和毒性反应

10、等确定给药方案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。静脉给药 和口服给药是较为理想的给药途径。给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效时要注意这两种给药途径 是有差别的。特殊情况下根据药物作用特点和推荐临床给药方法可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。不可采用 从饮水中给药的方式。3.4 评价标准3.4.1腹水瘤模型接种给药后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数。如阴性对照组20% 动物存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。采用中位生存时间（即 median survival time, MST）来

11、评价每组生存时间，其计算公式为：每组鼠数的中间数-中间生存天数前 死亡的鼠数MST =（中间生存天数-0.5）+中间生存天数死亡的鼠数治疗组与对照组的比较，采用 T/C（ %）来表示。计算公式为:TmstT/C %= X 100%CmstTmst :治疗组MST ； Cmst :阴性对照组MST评价的标准则以125%为界，当T/C %> 125%时，视为有效，反之则无效 报告格式见表1。表1 XXX对腹水瘤XXX的实验治疗作用。组别剂量给药动物数开始体重（克）中位生存时间T/C方式（只）(x 二SD)（天）(%)阴性对照 阳性对照 治疗组 高剂量 中剂量 低剂量342裸小鼠移植瘤模型推荐

12、使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2-3次，每次测量同时还需称鼠重。肿瘤体积（tumor volume,TV）的计算公式为：V = 1/2X ax b2 或 n /6x ax bx c其中a、b、c分别表示长宽高。由于此两公式的相关性极好，可采用任一 公式。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume, RTV）,计 算公式为：RTV = Vt / Vo。其中Vo为分笼给药时（即do）测量所得肿瘤体积，Vt 为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率 T/C（%）， 计算公式

13、如下：T RTVT/C % =X 100%CrtvTrtv:治疗组RTV ; Crtv:阴性对照组RTV。疗效评价标准：T/C % >60 %为无效；T/C % <60%,并经统计学处理P<0.05 为有效。报告格式见图1和表2;并应提供相应照片。表2 XXX对人癌裸小鼠移植瘤 XXX的实验治疗作用。组别剂量SD） RTVT/Cd0dn（x 士 SD）给药动物数一平均体重（克） TV（x 士P值方式d0 dnd0dn（%）阴性对照 阳性对照 治疗组高剂量中剂量低剂量dO:分笼给药时间；dn:实际治疗疗效最佳的时间。1.61.41.20.60.40.2积体瘤植移0.8时间（天）

14、注：图中为示意曲线。图1 XXX对人癌裸小鼠移植瘤 XXX的生长抑制作用。3.4.3 小鼠肿瘤模型生长较慢的小鼠肿瘤采用与裸小鼠移植瘤同样的量瘤径的评价方法。 生 长较快的小鼠肿瘤可采用称瘤重的方法评价。 试验结束后处死动物，称体重，解 剖剥离瘤块，称瘤重。阴性对照组肿瘤平均瘤重小于1克，或20%肿瘤重量小于 400毫克，表示肿瘤生长不良，试验作废。疗效评价公式：给药组平均瘤重-阴性对照组平均瘤重肿瘤生长抑制率100%阴性对照组平均瘤重评价标准：肿瘤生长抑制率40%为无效；肿瘤生长抑制率40%并经统计 学处理PV0.05为有效。报告格式见表3,并应提供相应照片。表3 XXX对动物移植瘤XXX的

15、实验治疗作用动物数平均体重（克）组别剂量给药瘤重（克）抑瘤率P值方式开始最后开始最后(x 士 SD)(%)阴性对照 阳性对照 治疗组高剂量中剂量低剂量3.4.4原位接种模型不同的原位接种模型可采用不同的评价方法，主要有瘤重和生存时间评价法。 如肝原位接种可用瘤重评价，颅内接种可用生存时间评价。评价方法、标准和注意事项 同腹水瘤模型和小鼠肿瘤模型。4各种类型抗肿瘤药物的特殊要求I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制的初步研究。非细胞毒类药物除完成上述体内外抗肿瘤试验，还应进行以下试验以证明其特定的抗肿瘤作用。4.1生物反应调节剂药效学包括两个方面：体内抗癌试验和免疫功能的研究。4.1.1体内抗癌试验

16、除参照本章“体内抗肿瘤试验”部分，尚应注意以下几点: 模型 因裸小鼠是免疫缺陷动物，一般应用正常免疫小鼠肿瘤模型。给药时间 可按常规给药，也可在肿瘤接种前预先给药几天，肿瘤接种后 继续给药或停药。肿瘤细胞接种量用于观察BRM类药物的肿瘤细胞接种量可比细胞毒类 药物低一个数量级，一般为（1-5）"05个瘤细胞/小鼠。给药方法可单独给药，也可与其它抗肿瘤药物合并使用，观察增效或减毒作用。4.1.2免疫功能试验方法具有抑瘤作用的生物反应调节剂，还需作免疫功能测定，以明确其抑瘤作用是否与免疫功能调控有关。免疫功能测定至少应做三项以 上(第二、第三和第五项必做)，包括细胞免疫和体液免疫两方面。

17、检测方法详见 本书“抗炎免疫药物药效学指导原则”中的“免疫调节药”部分。巨噬细胞功能测定天然杀伤细胞(natural kill cell)测定淋巴细胞转化试验淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphocyte-activated killer cell)测定各种细胞因子(cytokine)测定包括白介素11( IL-2 )、白介素VI(IL-6)、白介素XII(IL-12)、干扰素-Y (IFN- 丫)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )等。迟发型超敏反应检测4.2肿瘤耐药逆转剂4.2.1体外抗耐药活性试验 选择2-3对肿瘤耐药/敏感细胞株，采用MTT法、 XTT法或SRB法测定药物的细胞毒性。一般在

18、无毒剂量或相当于 IC10的剂量下 设三个剂量，并设立相应的阳性和阴性对照组。评价逆转效果用逆转倍数(foldreversal, FR表示：FR=IC5o(不加逆转剂)/IC5o(加逆转剂)。但必须注意以下方面：(1) 耐药株的耐药性耐药株因传代，尤其是撤药后耐药性可改变或消失；因此，试验前必须对试验耐药株进行耐药倍数(FR)的测定，以确保试验资料的可靠性；(2) 若非逆转多药耐药(MDR)而是逆转单药耐药，则实验的瘤株中需有针对该 药的耐药细胞株；(3)阳性对照药建议采用10卩M维拉帕米(verapamil, VPL)或 3 11 M 环抱菌素 A (cyclosporin A, CsA)。

19、4.2.2体内抗肿瘤耐药活性试验使用小鼠敏感和对应的耐药肿瘤和人癌裸小鼠敏感和对应的耐药移植瘤观察药物的体内抗肿瘤耐药活性。4.2.3耐药基因及其表达产物的测定在确定药物能逆转耐药的前提下，可测定肿瘤细胞内的药物浓度变化和耐药基因及其表达产物以初步明确其逆转耐药的 机制，包括多药耐药基因及其编码蛋白(multidrug resista nee gene/p-glycoprotein,Mdr1/Pgp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-relatedprotein, MRP)和肺耐药相关蛋白(lung resistance-relatedprotein, LRP)或其

20、它与耐 药相关的基因/蛋白及酶等。4.3 抗肿瘤转移药物肿瘤转移是多步骤的、借助循环途径和跨器官的复杂过程。肿瘤是否转移 不仅依赖于肿瘤细胞本身具有的内在转移潜能，而且也取决于机体抗转移因素的消长。所以，抗转移药物只有在动物体内模型上才能得出符合实际的结果。其药效学试验可在完成本章第2-3部分试验后进行如下试验：4.3.1体外试验测定候选化合物作用下肿瘤细胞对基底膜的侵袭、粘附和肿瘤细胞趋化性运动的能力。432体内试验模型 小鼠B16黑色素瘤、小鼠Lewis肺癌等和人癌裸小鼠高转移 移植瘤模型。接种方法常用静脉注射方法，也可用皮下接种或爪垫接种等方法。评价指标接种给药后，观察并记录动物死亡时间

21、，计算生存天数。试验结束后，称动物体重、肺重、移植瘤重，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶、测瘤 径（按本章测瘤径方法计算肺转移瘤体积）和病理组织学切片观察等；并计算转移 率，公式为：转移抑制率=1 -（治疗组转移率/对照组转移率）x 100%。4.4肿瘤血管生成抑制剂4.4.1 体外试验体外试验模型主要有：人血管内皮细胞模型包括人脐静脉血管内皮细胞和人微血管（肺、皮肤等）内皮细胞。血管形成促进因子如血管内皮生长因子 （vascular en dothelial growth factor,VEGF）或碱性成纤维细胞生长 因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）等

22、刺激细胞DNA合成、增殖、迁移、血管形成（tube formation）来观 察药物的抗血管形成作用。肿瘤细胞模型 主要应用国内已建立的人实体癌细胞系，确定VEGF、FGF等高分泌的细胞株。检测细胞增殖、转移能力及血管形成因子的基因表达状况来 评价药物。4.4.2 体内试验血管抑制试验寻找无血管区域或血管能明显与新生毛细血管相区别的区域进行肿瘤血管生成抑制剂筛选。经典的血管形成评价方法有：鸡绒毛膜尿 囊和卵黄膜囊（CAM ）、啮齿动物虹膜和角膜等。也可应用如皮下移植塑料或多 孔的polytetrafluoroethylene管、皮下移植无菌的海绵；一些自然的或化学修饰的 物质如Matrigel

23、和纤维凝胶等用于体内模型。抗肿瘤试验通过观察新生血管生成抑制剂的体内抗肿瘤效应检测移植瘤的血管密度、血管生成因子和抑制因子的分泌和表达， 以及肿瘤的转移情况 等综合评价肿瘤血管生成抑制剂的作用和作用机制。4.5分化诱导剂分化诱导剂的药效学研究包括体外和体内研究模型；目前的药物主要能对急性白血病进行有效的分化治疗。阳性对照药选用维甲酸类（retinoid）化合物。4.5.1体外试验白血病的分化诱导常用的细胞株有人急性早幼粒白血病细胞株HL-60、NB4细胞、人红白血病K562细胞等。可选择以下试验方法研究并判断结果：四唑氮蓝（NBT）还原试验：对照组细胞的还原能力W 10%，候选化合物的还 原能

24、力>50%;细胞形态学观察：可在光学显微镜与电镜下观察候选化合物作用后细胞的形态学变化，对照组的早幼粒细胞应 >90%-95%，候选化合物组细胞分化，成熟 粒细胞占比例越高，说明该化合物的分化效果越好；吞噬功能测定：对照组吞噬阳性细胞 <5%-10%，候选化合物组>50%。实体瘤的分化诱导常用细胞株、试验方法及评价标准如下：人肝癌HepG2、SMMC7721细胞分化诱导试验 主要测定细胞的甲 胎蛋白（AFP）、白蛋白含量，丫-谷氨酸转移酶（丫 -Glutmyl transferase，丫 -GT）、 酪氨酸转氨酶（tyrosi ne alpha-ketoglutarat

25、e tran sami nase, TAT ）活性及观察细胞 形态。分化细胞的AFP含量、TAT和丫 -GT活性明显降低，白蛋白含量增加， 细胞胞质增加、核缩小。人结肠癌HT-29细胞分化诱导试验该细胞可被分化为成熟的腺细胞，主要检测细胞粘液分泌，计算粘液分泌细胞百分率；测定其碱性磷酸酶活性；并 观察形态变化，分化细胞形成平坦状。如粘液分泌细胞>50%,碱性磷酸酶活性增加>100%则该候选化合物有效。小鼠黑色素瘤B16细胞分化诱导试验一般进行细胞的黑色素含量、酪氨酸酶活力测定和形态观察。有效的候选化合物可使细胞体积变大，多数细胞有树 突状（dendrite ）结构；黑色素含量增加2

26、倍以上，酪氨酸酶活力增加1倍以上。 4.5.2体内试验 常用人癌细胞小鼠肾囊膜下移植试验、小鼠髓单核细胞白血病 试验和人癌细胞裸小鼠移植瘤模型等。可选两种模型，根据肿瘤鼠生存时间、肿瘤的体积及形态变化，从整体水平观察分化诱导效果。重复试验一次。4.6 肿瘤治疗增敏剂肿瘤治疗增敏剂主要是指放射治疗增敏剂，能增加临床上恶性肿瘤放射治 疗或其它治疗的疗效及降低治疗后的复发率。其药效学试验分为体外和体内试 验：4.6.1体外试验 分别选择对放射、化疗药物具有中、低度敏感的人肿瘤细胞株， 采用MTT、SRB或细胞集落形成方法进行化合物的细胞毒性试验，以IC50值作为评价指标。多细胞球体（multicel

27、l spheroids）培养实验技术在研究增敏作用， 以及这些化合物的扩散和对乏氧细胞或休止期细胞的作用方面很有价值。可应用离体培养细胞的乏氧照射技术制作乏氧模型，评价增敏效果。氧增比（Oxygenenhancement ratio, OER可反映乏氧模型模拟肿瘤的缺氧情况，OER值达2.5-3.0即符合乏氧要求。乏氧条件下不给药组细胞存活曲线的Do值OER=一有氧条件下不给药组细胞存活曲线的Do值* Do值是杀伤 63%细胞所需的浓度。增敏比（Sensitivity enhancement ratio, SER及Ci.6作为评价被试药物增敏效果的指标。乏氧条件下对照组的Do值SER=乏氧条件

28、下给药组的Do值C1.6即SER=1.6时所需的药物浓度。C1.6（ mmol/L ）的值越小，表明药物的 增效作用就越强。一般C1.6>1.4认为有明显的增效作用。4.6.2体内试验选用对射线及化疗药物敏感性较小的三种实体瘤模型进行试 验，其中至少有一种是人癌裸小鼠移植瘤模型。放射治疗增敏剂的试验中一般用低LET（X或）射线照射，也可用高LET（中子、质子）照射。由强致癌物或病毒等 因素诱发的肿瘤，或者不是在同一品系动物身上移植传代的肿瘤往往会出现免疫 反应，因此都不能用于肿瘤治疗增敏剂的研究。疗效评价除参照本章“体内抗肿 瘤试验”部分，尚可观察（1）50%肿瘤控制剂量（TCD50），

29、即50%荷瘤动物的肿瘤 得到控制或治愈所需的照射剂量；（2）半数有效剂量（ED50）对50%的动物有效 的照射剂量（能使肿瘤的生长被抑制60 %以上视为有效）；（3）生长延缓（growthdelay）天数，即肿瘤受照后从一个特定大小（A）生长到某一特定大小（B）所需的时 间（Tx），然后与对照组（Tc）相比较，Tx-Tc为有效；增敏比，SER=照射对照组 Do值/给药组Do值;还应观察被试药物对正常组织是否也有影响，可进行治疗增 益系数（Therapentic Gain Factor, TGF。TGF指某种因子引起肿瘤组织细胞的损 伤与正常组织细胞的损伤之比，即TGF =肿瘤组织SER /正常

30、组织SER。参考文献1. DeGeorge JJ, et al. Regulatory considerations for preclinical development ofanticancer drugs. Cancer Chemother Pharmacol 1998;41:173-85.2. Page M, et al. In vitro methods. In: Teicher BA, eds., Anticancer drug development guide preclinical screening, clinical trials, and approval. Human

31、a Press Inc.: Totowa, NJ.1997: 3-56.3. Boyd MR, Some practical considerations and applications of the National Cancer Institute in vitro anticancer drug discovery screen. Drug Develop Res 1995;34:91-109.4. Waud WR, et al. In vivo methods: Teicher BA, eds., Anticancer drug development guide preclinic

32、al screening, clinical trials, and approval. Humana Press Inc.: Totowa, NJ.1997: 59-213.5. Hollingshead MG, et al. In vivo cultivation of tumor cells in hollow fibers. LifeSci 1995;57:131-141.6. Berger DP, et al. Establishme nt and characterizatio n of huma n tumor xeno graftsin thymus-aplastic nude

33、 mice. In Feibig HH, BergerDP, Eds. Immunodeficent Mice in Oncology. Basel, Karger, 1992; 42: 23-46.7. Maruo M.Method of tumor transplantation. In K.Nomura T , Sakurai Y, andIn aba M. The Nude Mouse and An tica ncer Drug Evaluati on. Japan, 1996; 205-214.8. Luk GD, et al. Sucessful treatment with DL

34、-a-difluoromethylornithine in established human small cell variant lung carcinoma implants in athymic mice. Cancer Res. 1983; 43: 4239.9. Guilband N, et al. In vivo antitumor activity of S16020-2, a new olivancine derivative. Cancer Chemother Pharmacol. 1996; 38 : 513-521.10. Stearns ME, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibition of primary human prostatecell-induced angiogenesis: IL-10stimulation of tissue inhibitor ofmetalloprotei nase-1 and in hibiti on of matrix metalloprote in ase (MMP)-2/MMP-9 secretion. Clin Cancer Res. 1999;5:189-96.11