第十三章 细胞衰老与凋亡

1、l教学目的教学目的：1 掌握细胞衰老与凋亡的概念掌握细胞衰老与凋亡的概念 2 探讨细胞衰老及凋亡的机理探讨细胞衰老及凋亡的机理教学重点教学重点： 1细胞衰老与凋亡的表现细胞衰老与凋亡的表现 2 细胞衰老与凋亡的机理细胞衰老与凋亡的机理 教学难点教学难点：细胞衰老与凋亡的机理：细胞衰老与凋亡的机理 l细胞凋亡是本章的重点内容。细胞凋亡是本章的重点内容。由于细胞凋由于细胞凋亡在有机体生长发育过程中具有极其重要亡在有机体生长发育过程中具有极其重要的意义，对它的研究受到了广泛的关注，的意义，对它的研究受到了广泛的关注，是近几年来的一个研究热点。要求掌握细是近几年来的一个研究热点。要求掌握细胞凋亡的研究

2、进展，包括细胞凋亡的形态胞凋亡的研究进展，包括细胞凋亡的形态和生化特征、分子机制和检测方法等。和生化特征、分子机制和检测方法等。l衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程衰老和死亡是生命的基本现象，衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。层次。l细胞衰老部分的内容在各院校历年考题中细胞衰老部分的内容在各院校历年考题中鲜有出现，考察内容集中于细胞凋亡上。鲜有出现，考察内容集中于细胞凋亡上。考察的重点也多为基础知识及检测方法，考察的重点也多为基础知识及检测方法，另外还涉及一部分凋亡的分

3、子生物学机理另外还涉及一部分凋亡的分子生物学机理部分的内容。部分的内容。l第一节第一节 程序性细胞死亡程序性细胞死亡l第二节第二节 细胞衰老细胞衰老l一、一、 动物细胞的程序性死亡动物细胞的程序性死亡l二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡l（一）细胞凋亡（一）细胞凋亡l1 1概念：概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程性死亡（程性死亡（programmed cell death,PCD）。）。在形态学上细胞在形态学上细胞凋亡的发生过程可分为凋亡的

4、发生过程可分为3个阶段：个阶段：l1 .凋亡的起始：凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布。l2. 凋亡小体的形成：凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折片段，与某

5、些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体。3. 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。凋亡凋亡小体小体限定要凋亡的细胞限定要凋亡的细胞 凋亡小体被邻近凋亡小体被邻近 细胞吞噬细胞吞噬 经降解被清除经降解被清除凋亡小体凋亡小体左，正常胸腺细胞；左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体）（注意凋亡小体）l2生物学意义：生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育，自稳态的维持以

6、及抵物个体的正常发育，自稳态的维持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。键的作用。例如：蝌蚪尾的消失，骨髓和例如：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。育，发育过程中手和足的成形过程。l形态学观测形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳电泳：DNA片段呈现出梯状条带片段呈现出梯状条带TUNEL测定法测定法，即，即DNA断裂的原位末端标记法断裂的原位末端标记法彗星彗星电泳法电泳法（comet assay）流式细胞分析流式细胞分

7、析：根据凋亡细胞：根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采断裂和丢失，采用碘化丙锭使用碘化丙锭使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。 downlDNA双链酶切双链酶切产生产生 3-OH末端末端脱氧核糖核脱氧核糖核苷酸末端转移酶（苷酸末端转移酶（TdT） 切口可被标记上生切口可被标记上生物素物素-dUTP 加入辣根过氧化酶的链霉亲和素加入辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP） 加底物二氨基联苯胺加底物二氨基联苯胺（DAB），若显示为棕色，即为凋亡细胞。），若

8、显示为棕色，即为凋亡细胞。l由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的的断裂，因而没有断裂，因而没有3-OH 形成，很少能够被染色。形成，很少能够被染色。最终通过计数每张切片上不同视野中最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。Fanhui Fanhui l诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子l1)物理性因子：物理性因子：包括射线（紫外线，射线等），包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。l2)化学及生物因子：化学及生物因子

9、：包括活性氧基团和分子，包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子子，肿瘤坏死因子?（TNF?），抗），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等。抗体等。l细胞凋亡的方式分为细胞凋亡的方式分为Caspase依赖性的和依赖性的和l不依赖于不依赖于Caspase的凋亡的凋亡l（1）Caspase家族家族lCaspase属于天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，属于天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的的关键酶关键酶，一旦被信号途径激活，能选择性地

10、切割一旦被信号途径激活，能选择性地切割细胞内的某些蛋白质，结果是使靶蛋白活化或失活，细胞内的某些蛋白质，结果是使靶蛋白活化或失活，使细胞不可逆的走向死亡。使细胞不可逆的走向死亡。l哺乳动物细胞哺乳动物细胞Caspase家族共有家族共有15种：种：lCaspase-1、4和和11负责白介素前体的活化；负责白介素前体的活化；lCaspase-2，-8，-9，-10，-11负责凋亡的起始；负责凋亡的起始；lCaspase-3，-6，-7是凋亡的执行者是凋亡的执行者。lBcl-2为凋亡抑制基因，为凋亡抑制基因， Bcl-2表达的蛋白表达的蛋白是是膜的整合蛋白膜的整合蛋白，其功能相当于线虫中的，其功能相

11、当于线虫中的ced-9。现已发现至少现已发现至少19个同源物，它们在线粒体参个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体能控制线粒体中细胞色素中细胞色素c等凋亡因子的释放。等凋亡因子的释放。l线粒体向细胞质释放的凋亡相关因子有：线粒体向细胞质释放的凋亡相关因子有：lAIF（apoptosis inducing factor)l限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶G（Endo G）上l是一种抑癌基因，其生物学功能是在是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视期监视DNA的完整性。如有损伤，的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到则抑制细胞增殖，直到DNA修复

12、完成。修复完成。如果如果DNA不能被修复，则诱导其调亡。不能被修复，则诱导其调亡。l症状症状：细胞质出现空泡，质膜破损、细胞内含：细胞质出现空泡，质膜破损、细胞内含物释放到胞外，引起周围组织的炎症反应。物释放到胞外，引起周围组织的炎症反应。l细胞坏死是细胞细胞坏死是细胞“程序性死亡程序性死亡”的一种形式；的一种形式；l如果分裂旺盛的细胞如果分裂旺盛的细胞DNA被持续损伤，就能引被持续损伤，就能引发细胞坏死。发细胞坏死。l自学自学l一、早期的细胞衰老研究一、早期的细胞衰老研究l二、二、Hayflick界限界限l三、衰老细胞结构的变化三、衰老细胞结构的变化l四、细胞衰老的分子机制四、细胞衰老的分子

13、机制l100多年前，多年前，魏斯曼魏斯曼曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说；曾提出种质不死而体质会衰老和死亡的学说；l后来，后来，Carrel和和Ebeling认为细胞本身不会衰老认为细胞本身不会衰老,衰老是由于环境的衰老是由于环境的影响造成的。影响造成的。l特别是特别是20世纪世纪40-50年代，由于年代，由于L系小鼠细胞和系小鼠细胞和Hela细胞系的建立，细胞系的建立，又使细胞不死性的观点更加巩固。又使细胞不死性的观点更加巩固。l直到直到60年代初，年代初，Hayflick等人的出色工作对细胞不死的观点彻底动等人的出色工作对细胞不死的观点彻底动摇了。摇了。lHayflickHayfli

14、ck通过对不同生物的胚成纤维细胞的体外通过对不同生物的胚成纤维细胞的体外培养，发现物种寿命和培养细胞寿命之间存在着培养，发现物种寿命和培养细胞寿命之间存在着确切的相互关系。确切的相互关系。举例举例? ?lHayflickHayflick巧妙的设计实验，进一步证明了决定细巧妙的设计实验，进一步证明了决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部环境。胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部环境。取老年男性个体的细胞取老年男性个体的细胞( (分裂分裂2020次，间期无巴氏次，间期无巴氏小体）和年轻女性个体的细胞（分裂小体）和年轻女性个体的细胞（分裂1010次，间期次，间期有巴氏小体）进行单独或混合培养，并统计

15、其倍有巴氏小体）进行单独或混合培养，并统计其倍增次数。增次数。结果发现，混合培养中的两类细胞的倍结果发现，混合培养中的两类细胞的倍增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养液，增次数与各自单独培养时相同，即在同一培养液，当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生当年轻细胞旺盛增殖的同时，年老细胞就停止生长了；长了；l年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，年轻细胞的胞质体与年老的完整细胞融合时，得到的杂种细胞不能分裂；年老细胞的胞质得到的杂种细胞不能分裂；年老细胞的胞质体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分体与年轻的完整细胞融合时，杂种细胞的分裂能力几乎与年轻细胞相同。裂能力几乎与年轻细胞相同。

16、 l该实验充分说明决定细胞的衰老是细胞核，该实验充分说明决定细胞的衰老是细胞核，而不是细胞质。而不是细胞质。l细胞，至少是体外培养的细胞，并非不细胞，至少是体外培养的细胞，并非不死的，而是有一定寿命的；它们的增殖死的，而是有一定寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限。能力不是无限的，而是有一定的界限。即即Hayflick界限界限。l1. 1. 细胞核的变化：细胞核的变化：核膜内折，染色质固缩，核膜内折，染色质固缩，核仁不规则。核仁不规则。2. 2. 内质网的变化：内质网的变化：年轻动物：年轻动物：RER RER 发育好、发育好、排列有序；年老动物：排列有序；年老动物：RERRER弥

17、散、总量减少。弥散、总量减少。l3.3.线粒体的变化：线粒体的变化：数量随龄减少，体积数量随龄减少，体积随龄增大。由于线粒体是细胞呼吸和氧随龄增大。由于线粒体是细胞呼吸和氧化的中心，有人称它是决定细胞衰老的化的中心，有人称它是决定细胞衰老的生物钟。而有些研究者则认为线粒体不生物钟。而有些研究者则认为线粒体不是衰老的启动者，而是受害者。是衰老的启动者，而是受害者。l4. 4. 致密体（脂褐质）的生成：致密体（脂褐质）的生成：是由溶酶体或是由溶酶体或线粒体转化而来的。它是自由基诱发的脂质过线粒体转化而来的。它是自由基诱发的脂质过氧化作用的产物。氧化作用的产物。l5. 5. 膜系统的变化：膜系统的变

18、化：目前资料表明，膜的改变目前资料表明，膜的改变确实与衰老有密切关系，年轻的功能健全的细确实与衰老有密切关系，年轻的功能健全的细胞膜是典型的液晶相。衰老的或有缺陷的膜处胞膜是典型的液晶相。衰老的或有缺陷的膜处于凝胶相或固相于凝胶相或固相. .l细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布发生变化细胞间间隙连接及膜内颗粒的分布发生变化. .l（一）氧化性损伤学说（自由基理论）（一）氧化性损伤学说（自由基理论）Harman50Harman50年代（年代（19561956）提出。认为衰老的一条重要的途径是）提出。认为衰老的一条重要的途径是因自由基脂质的过氧化而引起细胞功能的多方面异常。因自由基脂质的过氧化而引起细

19、胞功能的多方面异常。（二）端粒与衰老（二）端粒与衰老 发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的的“有丝分裂钟有丝分裂钟”学说（学说（Harley,1990Harley,1990）。端粒由）。端粒由富含富含G G、C C简简单重复顺序所组成，其长度随细胞衰老过程而逐渐缩短，但单重复顺序所组成，其长度随细胞衰老过程而逐渐缩短，但端粒酶却可维持端粒的长度。端粒酶却可维持端粒的长度。（三）（三）rDNArDNA与衰老与衰老 酵母酵母染色体外染色体外rDNA rDNA 环环（ERCERC）的积累，导致细胞衰老。）的积累，导致细胞衰老。l（四）

20、（四）SGS1基因、基因、WRN基因与衰老基因与衰老 SGS1基因和基因和WRN基因同源基因同源，编码解旋酶编码解旋酶;酵母酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平突变体寿命明显短于野生型（平均均9.5代代:24.5代）代）; wrn突变引发早老症。突变引发早老症。l细胞衰老是有机体在长期演化过程中形成细胞衰老是有机体在长期演化过程中形成的防止细胞过度生长或癌化的一种保护机的防止细胞过度生长或癌化的一种保护机制。机体的衰老并不等于所有细胞的衰老，制。机体的衰老并不等于所有细胞的衰老，但是细胞的衰老是同机体的衰老紧密相关但是细胞的衰老是同机体的衰老紧密相关的。的。l细胞衰老、细胞凋亡、细胞坏死、细胞衰老、细胞凋亡、细胞坏死、 Hayflic