小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定精品资料

1、小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要：过 氧化氢酶 (Catalase)是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、 红细胞中含量较多， 其生物学功能是催化细胞内 H2O2分解，防止过多 H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业， 以及医疗卫生业等多领域。过氧化氢酶分子量约为 238KD，结构上由 4 个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在 407nm波长下有特征性的吸收。溶于水 , 几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂， 酸性环境下溶解度低易析出， 最适温度为 37，最适 pH

2、值约为 7.8 。 本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。现报告如下：一、实验器材1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R 高速冷冻离心机，CU600 型电热恒温水箱， DYY-8L 型电泳仪（北京市六一仪器厂） ， H2S-H 水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司） ，垂直板型电泳装置，制冰机， 4冰箱二、实验方法1、过

3、氧化氢酶制备匀浆盐析过氧化氢酶制备透析层析匀浆是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出的方法。小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重6g ；按来1：8.5 的比例加入匀浆缓冲液 51ml（0.05mol/L 醋酸 -23.5%乙醇缓冲液， pH4.0）,匀浆机捣碎 3-5min ；缓慢滴加匀浆液体积 0.5 倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆 1min；匀浆液离心（ 4, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。盐析是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜， 使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。盐析法粗提过氧化氢酶：

4、缓慢加入上清液体积0.06 倍的 0.5mol/L 的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（ 4, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4 倍肝重（ 0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解 , 离心（ 4, 4000rpm, 10min ） , 保留上清备用。透析是利用透析袋的半透过性， 在一定透析条件下， 使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液： 20%乙醇， 0.1mol/L pH4.7 醋酸缓冲液， 0.1mol/L 氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（

5、 4 , 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于 0.1mol/L pH7.8 磷酸缓冲液中 , 离心（ 4 ,4500rpm, 10min ）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（ 3 组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于 50% 的甘油中包埋浓缩 24 小时后放冰箱保存，制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活， 分析制备效率。 分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。层析是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。分别在 280nm和 407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化

6、过的过氧化氢酶。取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约 25 滴，一次在 407nm和 280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。2、过氧化氢酶的性质测定纯度及分子量测定 (SDS-PAGE)过氧化氢酶测定蛋白含量测定 (lowry法)米氏常数值测定(Lineweaver - Burk双倒数作图法 )电泳电泳是根据带电颗粒在电场作用下向着预期与其电荷相反的电极移动的现象，蛋白质电泳迁移率主要取决于它的相对分子量。 所以用电泳法可测定过氧化氢酶的分子量。用定量移液器把样品和 MAKER加在配好的 SDS-

7、聚丙烯酰胺凝胶垂直板的样品槽内，接上电源开始电泳 （ 55min），取出凝胶，用考马斯亮蓝 R-250 染色 15min；脱色后放置一周后观察蛋白质条带情况，并计算相对迁移率lowry 法测定纯化的过氧化氢酶浓度是根据蛋白质中的酪氨酸与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比的方法。作出标准曲线的到过氧化氢酶的浓度制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。标准蛋白溶液的配制： 将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量， 再用无离子水配成 0.1mgmL储存液。按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组， 编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上

8、测定 650mn处的光密度值。以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。米式常数值测定滴定法：以 H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解 10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的 H2O2，换算出减少的 H2O2的量，进而计算出酶的活力。在 Km值测定中采用此法测定酶活力。过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1molH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位 （U）。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。三、实验结果层析后蛋白吸光度变化曲线图波长吸光试度管序号161718407nm280nm0.0930.1580.1080.1890.1350.234190.4750.264200.1520.222210.1710.210220.1700.194图如下：SDS-PAGE测定过氧化氢酶分子量标准蛋白分子量样品迁移距BPB的迁移LgMrRf离(cm)距离 (cm)A974004.990.40.084B662004.820.70.148C427004.631.40.2964.73D310004.492.00.422E