-生物样品分析方法的建立和确证8

1、生物样品分析方法的建立和确证生物样品分析方法的建立和确证药物非临床药代动力学研究技术指导原则（第二稿）药物非临床药代动力学研究技术指导原则（第二稿）,2013,2013年年4 4月月Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation，FDA, 2001Guideline on bioanalytical method validation , EMA, 21 July 2011 孟志云野战输血研究所血液药理学研究室院药物代谢动力学重点实验室010-11. 简介2.体内药物分析方法设计与建立3.方法学确证内容内容21.1 生物样品分析是药代

2、研究的必备生物样品分析是药代研究的必备手段手段分析化学是化学科学中的分析化学是化学科学中的“眼睛眼睛”透过透过“窗户窗户”获得大量的信息获得大量的信息定量分析定量分析定性分析（半定量）定性分析（半定量）1. 1. 简简 介介31.2 1.2 方法学类型及特点：方法学类型及特点： 体内药物分析方法大致可归为：体内药物分析方法大致可归为： 1. 色谱法：色谱法：吸附、分配、分子筛、离子交换、亲和等，吸附、分配、分子筛、离子交换、亲和等， HPLC-UV，HPLC - MS 41.2 1.2 方法学类型及特点：方法学类型及特点： 2. 免疫分析法免疫分析法 ： ELISA ，enzyme-linke

3、d immunosorbentassay EIA，enzyme immunoassay RIA，radioimmunoassay 51.2 1.2 方法学类型及方法学类型及特点特点 3. 同位素同位素: 1H 14C 125I 125I 131I Gamma counter氧化燃烧炉 14C 3H液体闪烁仪 14C 3H6 体内药物分析方法体内药物分析方法特点特点 灵敏度灵敏度高：高： 浓度低浓度低 受到给药剂量的限制受到给药剂量的限制 受到受到生物利用度的限制生物利用度的限制 专一性专一性好：好： 生物生物内源性物质的干扰内源性物质的干扰 体内新形成的代谢产物干扰体内新形成的代谢产物干扰 样

4、品样品量少：量少： 血液血液（血浆、血清、全血）（血浆、血清、全血） 尿尿、胆汁、唾液、汗液、脑脊液、胆汁、唾液、汗液、脑脊液 粪便粪便、组织器官、组织器官7 方法方法快捷快捷： 不是不是专门的方法学研究，专门的方法学研究， 利用方法较快的阐明药理学的问题。利用方法较快的阐明药理学的问题。 可靠可靠、重现性好：、重现性好： 药药代实验的不可重复性。代实验的不可重复性。 药物药物类型多：类型多： 需要需要多种仪器、技术手段的配套多种仪器、技术手段的配套81. 2.1 光谱分析法光谱分析法 比色法比色法 紫外分光光度法紫外分光光度法 荧光分光光度法荧光分光光度法1. 2.2 色谱法色谱法 分离效率

5、高分离效率高; 专一性较高专一性较高 HPLC: 适用范围广适用范围广; 室温检测室温检测; 样品预处理简单样品预处理简单; 流动相选择范围广流动相选择范围广; 仪器自动化程度高仪器自动化程度高 GC: 化合物气化；载气种类少；化合物气化；载气种类少； 方法灵敏，但受到进样量的限制方法灵敏，但受到进样量的限制 TLC: 灵敏度低，现较少使用灵敏度低，现较少使用9 1.2.3 毛细管电泳毛细管电泳法法 分离效率高分离效率高; 专一性较高专一性较高 毛细管区带电泳毛细管区带电泳 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱 毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳 毛细管等电聚焦毛细管等电聚焦 毛细管等速电泳毛细管等

6、速电泳 毛细管电色谱法毛细管电色谱法进样量少，检测条件受限制。10 1.2.5 同位素法同位素法: : 灵敏度灵敏度高高; ; 专一性差专一性差 放射强度表示标记药物量放射强度表示标记药物量( (eq.ng/ml) 同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性同位素技术与其他分析法相结合以提高专一性 1.2.4 免疫分析法免疫分析法: 放射免疫分析放射免疫分析 酶免疫分析酶免疫分析 荧光免疫分析荧光免疫分析11122. 2. 体内药物分析方法设计与建立体内药物分析方法设计与建立2.1 体内药物分析方法设计的主要依据体内药物分析方法设计的主要依据2.1.1 明确分析方法设计的目的要求明确分析方法设计

7、的目的要求 a. 临床药物临床药物监护监护 简便简便、快速、批量测定、快速、批量测定 b b. .药代动力学药代动力学研究研究 是否是否要求原形药物与代谢物同时测定要求原形药物与代谢物同时测定 注意注意整个浓度变化的范围整个浓度变化的范围 样品样品量多量多, , 方法尽可能简便方法尽可能简便13 c. 配合新药设计合成配合新药设计合成、药理药理、毒理毒理学的学的研究研究 药物药物是否吸收是否吸收? ? 生物利用度如何生物利用度如何? ? T1/2? Tmax? Cmax? 化合物药代的快速评价化合物药代的快速评价 要求方法学简单，快捷的提供实验数据。要求方法学简单，快捷的提供实验数据。 d.

8、新药新药报批报批 参照参照CFDACFDA颁布的指导原则颁布的指导原则, ,按照按照SOPSOP进行试验进行试验. .较快的获得信息较快的获得信息142.1.2 了解待测药物的特性了解待测药物的特性, , 调研文献调研文献 药物的结构、理化性质药物的结构、理化性质 检测检测方法方法? ? 溶解度溶解度? ? 稳定性稳定性? ? 药物的药理和毒理作用机制药物的药理和毒理作用机制 生物样品生物样品: :动物属性动物属性? ? 组织器官组织器官? ? 体内体内代谢情况代谢情况 药物的剂量药物的剂量 给药途径给药途径 干扰干扰成分的多少成分的多少 样品样品的预处理方法的预处理方法 152.1.3 仪器

9、设备与实验室条件仪器设备与实验室条件 文献资料的可参考性文献资料的可参考性? ? 可重复性可重复性? ? 别人可做的事情是否适合我们别人可做的事情是否适合我们? ? 实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配实验室硬件建设是否与研究课题相互匹配? ? 162.2 体内药物分析方法设计与建立的一般体内药物分析方法设计与建立的一般步骤步骤根据被测药物的性质根据被测药物的性质药物浓度的大致范围药物浓度的大致范围( (经验估计经验估计) )仪器设备条件仪器设备条件对药物和研究目的的理解程度对药物和研究目的的理解程度灵敏灵敏 专一专一 简捷简捷 可行可行 初步分析方法的预试初步分析方法的预试优化优化确证确证生

10、物样品测定的关键是方法学的确证（Validation）。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究对建立的方法进行确证。制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。生物样品测定的关键是方法学的确证（Validation）。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究对建立的方法进行确证。制备随行标准曲线并对质控样品

11、进行测定，以确保检测方法的可靠性。173生物样品分析方法的确证生物样品分析方法的确证183生物样品分析方法的确证生物样品分析方法的确证分析方法确证分为分析方法确证分为全面确证和部分确证全面确证和部分确证两种情况两种情况全面方法确证全面方法确证：首次建立的生物样品分析方法、新的药物或首次建立的生物样品分析方法、新的药物或新增代谢物定量分析新增代谢物定量分析部分方法确证部分方法确证：如生物样品分析方法在试验室间的转移、定如生物样品分析方法在试验室间的转移、定量浓度范围改变、生物基质改变、稀少生物基质、证实复方量浓度范围改变、生物基质改变、稀少生物基质、证实复方给药后分析方法的特异性等给药后分析方法

12、的特异性等19生物样品分析方法的全确证生物样品分析方法的全确证特异性特异性标准曲线和定量范围标准曲线和定量范围精密度和准确度精密度和准确度定量下限定量下限稳定性稳定性提取回收率提取回收率微生物学和免疫学分析微生物学和免疫学分析20CFDA21FDA22EMA23基本概念基本概念 准确度准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。 精密度精密度：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的：在确定的分析条件下，相同基质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。一系列测量值的分散程度。 特异性特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。

13、这：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、基质组分等。些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、基质组分等。24基本概念基本概念 灵敏度灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下：生物样品分析方法的灵敏度主要通过测定定量下限样品的准确度和精密度来表征。限样品的准确度和精密度来表征。 重现性重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。 稳定性稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基：

14、一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定基质中的化学稳定性。质中的化学稳定性。25基本概念基本概念 标准曲线标准曲线：试验：试验响应值与分析物浓度间响应值与分析物浓度间的关系。应采的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的连续的和可重现的，应以回，应以回归计算结果的归计算结果的百分偏差最小百分偏差最小为基础。为基础。 提取回收率提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。理过程前后分析物含量百分比表示。2

15、6基本概念基本概念 定量范围定量范围：包括定量上限（：包括定量上限（ULOQ）和定量下限（）和定量下限（LLOQ）的）的浓度范围，在此范围内采用浓度浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。重复的定量，其准确度和精密度可以接受。 生物基质生物基质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。 基质效应基质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间：由于样品中存在干扰物质，对响应

16、造成的直接或间接的影响。接的影响。27基本概念基本概念 分析批分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。几天完成。 标准样品标准样品：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于：在生物基质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。 质控样品质控样品：即：即QC样品，系指在生物基质中加入已知量分析物样品，系指在生物基质中加入已知

17、量分析物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。批中未知样品分析结果的完整性和正确性。28(1) 特异性特异性至少要考察至少要考察6个不同个体个不同个体空白生物样品空白生物样品色谱图色谱图空白生物样品外加空白生物样品外加对照物质对照物质色谱图（注明浓度）色谱图（注明浓度）用药后的生物样品用药后的生物样品色谱图色谱图对于以软电离质谱为基础的检测方法（对于以软电离质谱为基础的检测方法（LC-MS、LC-MS/MS等），应考察等），应考察基质效应基质效应293031323334(2) 标准曲线和

18、定量范围标准曲线和定量范围标准曲线标准曲线高低浓度范围高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。至少至少5个个非零非零浓度浓度建立标准曲线建立标准曲线，使用与待测样品相使用与待测样品相同的生物基质同的生物基质不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度建立标准曲线时应建立标准曲线时应随行空白生物样品随行空白生物样品，但计算时不包，但计算时不包括该点括该点353637RitonavirY = 0.00360691+0.0049861*X R2 = 0.9975

19、 W: 1/X20200040006000800010000ng/ml05101520253035404550Area Ratio图图1 典型标准曲线典型标准曲线38(3)精密度和准确度精密度和准确度3个浓度个浓度，低浓度，低浓度在定量下限的在定量下限的3倍或倍或3倍以内倍以内，高浓度接近于标准曲线高浓度接近于标准曲线的上限的上限，中间选一个浓度中间选一个浓度每一浓度每批至少测定每一浓度每批至少测定5个样品个样品，至少，至少3个分析批个分析批精密度精密度用质控样品的批内和批间相对标准差（用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）表示，相对标准差）表示，相对标准差一般应小于一般应小于15%，在定

20、量下限附近相对标准差应小于，在定量下限附近相对标准差应小于20%准确度准确度一般应在一般应在85%115%范围内，在定量下限附近应在范围内，在定量下限附近应在80%120%范围内范围内394041(4)定量下限定量下限定量下限是标准曲线上的定量下限是标准曲线上的最低浓度点最低浓度点至少能满足测定至少能满足测定35个半衰期个半衰期时样品中的药物浓时样品中的药物浓度，或度，或Cmax的的1/101/20时的药物浓度时的药物浓度准确度准确度应在真实浓度的应在真实浓度的80%120%范围内，范围内，RSD应小于应小于20%，由至少由至少5个标准样品个标准样品测试结果证明测试结果证明4243(5) 稳定

21、性稳定性含药生物样品含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间以及不同存放时间的稳定性的稳定性储备液储备液的稳定性的稳定性样品处理后样品处理后的溶液中分析物的稳定性的溶液中分析物的稳定性44454647484950(6)提取回收率提取回收率考察高、中、低考察高、中、低3个浓度的提取回收率个浓度的提取回收率结果应精密和可重现结果应精密和可重现51基质效应基质效应(matrix effect)52基质基质效应效应和提取回收率和提取回收率Matrix Effect=B/CExtraction Efficiency= A/B53提取回收率提取回收率54基质效应基质效应

22、55稀释效应稀释效应5657携带效应携带效应（ Carryover Evaluation）在方法评价中，线性的最高浓度（如1000ng/ml）被测试之后，必须测试试剂空白样品来评价Carryover 。在样品出峰的时间（RT）,试剂空白样品可能会出现一个相应的信号，这个信号是LLOQ的百分之几（LLOQ%）? LLOQ: 1.0 ng/ml; Acceptance: 0.8-1.2 ng/ml , (1.0 ng/ml 的 20%) ; 在进样高浓度样品时，在分析系统中会产生“携带污染”；“污染” 到什么程度时，分析方法可以接受；什么程度时，分析方法不可以接受58Carryover可允许接受的

23、范围可允许接受的范围 “20% of LLOQ”如果：如果： 方法学的方法学的 LLOQ = 1ng/ml那么：那么： X 0.2ng/ml 59假定：在validation试验中，观察到1000ng/ml（线性范围的 最高浓度）样品引起 50% of Carryover (残留量)，指的是LLOQ的50%;(1ng/ml的50% = 0.5ng/ml)“cut-off”浓度(残留量在20%的LLOQ以下的药物浓度)：1000ng/ml 0.5ng/ml = X 0.2ng/ml X = 400ng/ml60携带效应实验携带效应实验61未知样品再分析未知样品再分析Incurred Sample

24、s Reanalysis(ISR)62Incurred Samples Reanalysis(ISR)63部分确证部分确证64656667微生物学和免疫学分析微生物学和免疫学分析标准曲线本质上是非线性的，所以尽可能标准曲线本质上是非线性的，所以尽可能采用比化学分析采用比化学分析更多的浓度点来建立标准更多的浓度点来建立标准曲线曲线如果如果重复测定重复测定能够改善准确度，则应在方能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步骤法确证和未知样品测定中采用同样的步骤68生物样品分析方法生物样品分析方法的应用的应用1.在生物样品分析方法在生物样品分析方法确证完成之后确证完成之后开始测试未知样品。开始测试未知样品。2.推荐由独立的人员配制不同浓度的标准样品推荐由独立的人员配制不同浓度的标准样品对分析方法进行对分析方法进行考核考核。3.每个未知样品一般测定一次，每个未知样