高等药物化学

1、DNA Methyltransferases（DNMTs）小组成员：户 彪 阮 霞 赵丽杰 王 帅2014.11.7主要内容主要内容研究背景研究背景DNMTs分类及其结构分类及其结构DNMTs的功能的功能DNMTs抑制剂的相关研究抑制剂的相关研究表观遗传学是研究基因的表观遗传学是研究基因的DNADNA序列不发生变化的前提下，通过核苷序列不发生变化的前提下，通过核苷酸或染色体的可逆性修饰使基因表达可遗传的变化的遗传学分支学酸或染色体的可逆性修饰使基因表达可遗传的变化的遗传学分支学科。科。研究背景研究背景近年来表观遗传学成为生物学、医学等领域内的研究热点，越来近年来表观遗传学成为生物学、医学等领域

2、内的研究热点，越来越多的研究证明，很多疾病的发生与表观遗传修饰的异常相关，越多的研究证明，很多疾病的发生与表观遗传修饰的异常相关，如哮喘、肝癌、和如哮喘、肝癌、和HMT（histone methyl transferase）异常引）异常引起的多种肿瘤等。因此。人们越来越认识到表观遗传学的相关研起的多种肿瘤等。因此。人们越来越认识到表观遗传学的相关研究在人类许多疾病的防治过程中具有的重要意义。究在人类许多疾病的防治过程中具有的重要意义。表观遗传学的调控机制主要包括表观遗传学的调控机制主要包括DNA甲基化（甲基化（DNA methylation）、）、组蛋白修饰（组蛋白修饰（histone mod

3、ification）、非编码）、非编码 RNA（noncoding RNA，ncRNA）作用等。）作用等。DNA甲基化与肿瘤的关系甲基化与肿瘤的关系肿瘤发生是一个多步骤、多阶段的复杂过程肿瘤发生是一个多步骤、多阶段的复杂过程 , ,包括原癌基因激包括原癌基因激活和抑癌基因失活。活和抑癌基因失活。 近来近来 ,人们发现肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低人们发现肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低 ,但是但是伴有某些伴有某些 CpG岛甲基化程度增高。岛甲基化程度增高。 位于正常细胞表达基因启动子附近的位于正常细胞表达基因启动子附近的 CpG岛通常处于非甲基岛通常处于非甲基化状态；而在肿瘤细胞中化

4、状态；而在肿瘤细胞中 ,这些这些 CpG岛变为甲基化状态岛变为甲基化状态 ,其相其相关抑制基因的表达亦被关闭。抑癌基因的启动子区甲基化水关抑制基因的表达亦被关闭。抑癌基因的启动子区甲基化水平偏高，所以平偏高，所以研究研究DNA甲基化转移酶抑制剂，以期能够产生甲基化转移酶抑制剂，以期能够产生抗癌效果。抗癌效果。DNA 甲基化是第一个被确认的表观遗甲基化是第一个被确认的表观遗传学修饰，参与调控基因表达和细胞分传学修饰，参与调控基因表达和细胞分化的过程。化的过程。 DNA 的存在不是孤立的，的存在不是孤立的，而是和组蛋白及其它染色体相关蛋白形而是和组蛋白及其它染色体相关蛋白形成一个复合体。在真核细胞

5、中，成一个复合体。在真核细胞中，DNA 以染色体的形式存在，核小体是染色体以染色体的形式存在，核小体是染色体的基本组成单位，由的基本组成单位，由 146 bp DNA 缠绕缠绕在以组蛋白在以组蛋白 H2A、H2B、H3 和和 H4 各各两个分子为中心的八聚体上组成，每个两个分子为中心的八聚体上组成，每个核心组蛋白由一个折叠区和一个氨基末核心组蛋白由一个折叠区和一个氨基末端结构域形成，其显著特征是其氨基末端结构域形成，其显著特征是其氨基末端伸向外围，易于被甲基化、乙酰化、端伸向外围，易于被甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共价修饰。另一类蛋磷酸化、泛素化等共价修饰。另一类蛋白，组蛋白白，组蛋白 H

6、1，可与线形，可与线形 DNA 结合结合以帮助后者形成高级结构与核小体相连。以帮助后者形成高级结构与核小体相连。 一、一、DNA甲基化甲基化DNA甲基化是指在甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫腺苷甲硫氨酸为甲氨酸为甲基供体，在基供体，在CpG二核苷酸的胞嘧啶分子的二核苷酸的胞嘧啶分子的5碳原子上添加一个甲基基碳原子上添加一个甲基基团的化学修饰团的化学修饰 。DNA的甲基化修饰主要发生在的甲基化修饰主要发生在CpG岛岛（CpG islands, CpGIs），即跨，即跨越至少越至少200 个碱基对个碱基对 ，GC 含量超过含量超过 50%的的 DNA 片段

7、，片段，主要位于基因主要位于基因的启动子和第一外显子区域的启动子和第一外显子区域 。首先首先DNA甲基化转移酶与甲基化转移酶与DNA结合结合, 将目标核苷酸反转暴露将目标核苷酸反转暴露于于DNA双螺旋之外双螺旋之外, 并嵌入酶的袋形催化结构域里。与此同并嵌入酶的袋形催化结构域里。与此同时时, 碱基对氢键断裂碱基对氢键断裂, 邻近碱基间堆积作用缺失。邻近碱基间堆积作用缺失。DNA-C5甲甲基转移酶的活性位点基转移酶的活性位点(motif IV)中的保守序列中的保守序列PCQ中的半胱氨中的半胱氨酸残基中的硫醇基对底物酸残基中的硫醇基对底物C6位碳进行亲核作用位碳进行亲核作用, 并形成共价并形成共价

8、键激活。由于键激活。由于S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团结合于的甲基基团结合于S原子原子上上, 分子极不稳定分子极不稳定, 在酶的作用下甲基从在酶的作用下甲基从SAM转移至被激活转移至被激活的的C5, 随着随着C5位上质子的释放与共价中间物的转变位上质子的释放与共价中间物的转变, 最终完最终完成成DNA的甲基化修饰过程。的甲基化修饰过程。 原理原理二、二、DNMTs1948年年Hotchkiss在牛胸腺内观察到甲基转移酶催化的在牛胸腺内观察到甲基转移酶催化的DNA甲甲基化基化; 1964年年, Gold 和和Hurwitz等在等在Escherichia coli中鉴定出第中鉴定

9、出第一个一个DNA甲基转移酶。甲基转移酶。 分类分类DNA甲基化转移酶（甲基化转移酶（DNMTs）催化和维持）催化和维持DNA的甲基化。的甲基化。根据催化根据催化反应类型反应类型 将腺嘌呤转化成将腺嘌呤转化成N6-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤; （原核生物）（原核生物） 将胞嘧啶转化成将胞嘧啶转化成N4-甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶; （原核生物）（原核生物） 将胞嘧啶转化成将胞嘧啶转化成C5-甲基胞嘧啶。（原核生物；真核生物）甲基胞嘧啶。（原核生物；真核生物）DNMTs DNMT3aDNMT3LDNMT3b催化催化DNA复制复制过程中的半甲过程中的半甲基化基化CpGs维持甲基化维持甲基化从头甲基化从头甲基化

10、催化胚胎发催化胚胎发育期甲基化育期甲基化DNMT1调节蛋白调节蛋白DNMT2tRNA甲基甲基转移酶转移酶微弱的微弱的DNA甲甲基化酶活性基化酶活性（哺乳动物）（哺乳动物）维持性甲基化酶维持性甲基化酶DNMT1，可在甲基化的，可在甲基化的DNA模板链指导下在对应部位发生甲基模板链指导下在对应部位发生甲基化；二是从头甲基化酶化；二是从头甲基化酶DNMT3，它必需甲基化的，它必需甲基化的DNA模版，可以使完全非甲基模版，可以使完全非甲基化的化的DNA完全甲基化修饰。完全甲基化修饰。DNMT1(维持甲基化维持甲基化)DNMT3(从头甲基化从头甲基化)DNMTs的甲基化作用的甲基化作用几乎所有的甲基化胞

11、嘧啶残基都出现在对称序列的几乎所有的甲基化胞嘧啶残基都出现在对称序列的5GC-3二核苷酸上二核苷酸上1、DNMT1DNMT1是是1988年年Bestor等从真核生物克隆出来的第一个等从真核生物克隆出来的第一个DNA甲基转移酶。甲基转移酶。DNMT1结构结构183 kDaN-末端大结构域末端大结构域C-末端则为催化结构域末端则为催化结构域(CatD),11241 620aa 处处带电结构域带电结构域(结合结合DMP1转录抑制蛋白转录抑制蛋白)核定位信号核定位信号(NLS)PCNA结合位点结合位点复制叉作用位点复制叉作用位点锌离子结合域锌离子结合域CXXC(ZnD)polybromo结构域结构域m

12、otif、折叠一起形成折叠一起形成SAM结合位点结合位点motif IV 中的中的PRO-CYS二肽二肽, 提供活性提供活性位点中的甲醇基位点中的甲醇基包含众多调控位点包含众多调控位点, 参与细胞参与细胞内定位及催化活性的调节内定位及催化活性的调节包含包含6 个甲基转移酶高度保守位点个甲基转移酶高度保守位点, motif、等等ZnD 优先识别甲基化优先识别甲基化CpG, ZnD与甲基化与甲基化DNA结合可以结合可以引发引发DNMT1催化中心的异构激活催化中心的异构激活, 从而引起甲基化蔓延。从而引起甲基化蔓延。CatD优先作用于半甲基化底物优先作用于半甲基化底物DNMT1还存在还存在3 个不同

13、的剪接异构体个不同的剪接异构体:DNMT1s, DNMT1o和和DNMT1p。 DNMT1s表达于体细胞中表达于体细胞中, DNMT1p只发现于粗线期精母细胞只发现于粗线期精母细胞, DNMT1o 特异性表达于卵母细胞和着床前胚胎中特异性表达于卵母细胞和着床前胚胎中。DNMT1 的主要作用是在的主要作用是在 DNA 的复制和修复中维持其甲基化，特异性的复制和修复中维持其甲基化，特异性的作用于半甲基化的的作用于半甲基化的 CpGs 二核苷酸。二核苷酸。DNA 复制后，复制后，DNMT1 可识别可识别半甲基化的半甲基化的 CpGs 并依照模板链的甲基化模式合成新的甲基化并依照模板链的甲基化模式合成

14、新的甲基化 DNA。通过这个过程，通过这个过程， DNA 的甲基化修饰得以遗传下来。的甲基化修饰得以遗传下来。DNMT1p不具有不具有DNMT1活性活性, 因为它的第一外显子因为它的第一外显子ORF太短太短, 可能干扰可能干扰了正常翻译了正常翻译。DNMT1oN-末端缺少末端缺少118个氨基酸个氨基酸, 但是获得了更高的稳定性但是获得了更高的稳定性, 在卵细胞在卵细胞胞浆能够长期存在。当胚胎发育至胞浆能够长期存在。当胚胎发育至8细胞阶段时细胞阶段时, DNMT1o 从胞浆转移从胞浆转移至核内至核内, 并在第四次并在第四次S期复制中维持印记基因的甲基化期复制中维持印记基因的甲基化。DNMT1s是

15、复制后维持甲基化的关键酶是复制后维持甲基化的关键酶, 沿沿DNA高速进行性甲基化高速进行性甲基化, CGCTC位点趋向终止此过程位点趋向终止此过程, 它可能是它可能是DNMT1作用的终止子作用的终止子, 但同时但同时也是阻遏也是阻遏转录因子转录因子CTCF的结合位点的结合位点, 通过募集通过募集CTCF或独立途径能够阻或独立途径能够阻止止DNA甲基化作用向甲基化作用向DNA非甲基化区域蔓延扩展非甲基化区域蔓延扩展。DNMT1构象上的变化与活性状态转变有关构象上的变化与活性状态转变有关, 能能影响近端氨基酸和催化结影响近端氨基酸和催化结构域的结合构域的结合, 还可能引起还可能引起Ser515的磷

16、酸化的磷酸化。DNMT3a和和DNMT3b拥有类似的结构拥有类似的结构: 2、DNMT3 (1998年年)半胱氨酸富集的半胱氨酸富集的Zn 结合位点结合位点(含有多个含有多个Cys、 6 个个CXXC结构结构)高度可变的高度可变的N-末端末端具有催化功能的具有催化功能的C 末端末端由于由于DNMT3a、DNMT3b的的DNA结合位点均较小结合位点均较小, 大约大约50个残基左右个残基左右, 因因此此, DNMT3常以二聚体形式存在以增大和底物的接触面常以二聚体形式存在以增大和底物的接触面, 在一次作用过程在一次作用过程中可以同时甲基化两个中可以同时甲基化两个CpG位点。位点。PWWP (Pro

17、line tryptophan tryptophan proline)结构域结构域, 其可能与其可能与DNA非特异性结非特异性结合有关合有关;DNMT3a 和和 DNMT3b 的功能主要是针对未甲基化的的功能主要是针对未甲基化的 CpGs 开始重新开始重新甲基化（甲基化（de novo methylation），对，对CpG位点的侧翼序列有一定的倾位点的侧翼序列有一定的倾向性。向性。5-CTTACpGCAAG-3优先被识别优先被识别, 而对而对5-TGTTCpG GTGG-3几乎没有活性。几乎没有活性。重新甲基化的过程重新甲基化的过程主要发生在胚胎干细胞和癌症细主要发生在胚胎干细胞和癌症细胞。

18、胞。DNMT3a对富含对富含CpG的片段甲基化效率不高的片段甲基化效率不高, 但是其作用更但是其作用更准确。准确。区别区别：DNMT3b能够甲基化着丝粒远端的重复序列能够甲基化着丝粒远端的重复序列, 其间具有高密其间具有高密度的度的CpG位点位点, 它是以进行性方式行使甲基化功能的它是以进行性方式行使甲基化功能的, 这种这种方式有利于短时间的甲基化。方式有利于短时间的甲基化。在在DNMT3a和和DNMT3b缺乏的缺乏的胚胎干胚胎干细胞中细胞中, DNMT3L 散散在分布于核和胞浆内在分布于核和胞浆内。分布分布在结构上在结构上, DNMT3a与与DNMT3L 形成一个四聚体形成一个四聚体, DN

19、MT3a 二聚体二聚体位于中间位置位于中间位置, DNMT3L 二聚体位于外侧二聚体位于外侧, 两者通过两者通过C-端相接触。端相接触。通过通过C-端的端的G718-L719-Y720结构结构, DNMT3L能够稳定能够稳定DNMT3a活活性位点的构象性位点的构象, 包括亲核基团包括亲核基团Cys706。DNMT3a- DNMT3L的结合的结合提供了一个稳定而广泛的极性作用提供了一个稳定而广泛的极性作用, 增强了增强了DNMT3a与与SAM的结合。的结合。 DNMT3a和和DNMT3b 存在时，存在时，DNMT3L作为作为DNA从头甲基化调从头甲基化调节因子节因子可以通过与可以通过与DNMT3

20、a和和DNMT3b的的C端结合端结合而转移入细胞而转移入细胞核内核内, 可提高它们的催化活性可提高它们的催化活性, 正向调节正向调节DNA从头甲基化。从头甲基化。作用：作用：DNMT3L是一种是一种DNMT3类似蛋白类似蛋白, 具有半胱氨酸富集的锌结合区域具有半胱氨酸富集的锌结合区域, 缺少缺少C端的酶催化活性域端的酶催化活性域, 所以没有单独的催化活性。所以没有单独的催化活性。DNMT2存在于胞浆和核内存在于胞浆和核内, 细胞内定位显示大量的细胞内定位显示大量的DNMT2结合于核结合于核基质处基质处, 在有丝分裂前期进入细胞核内在有丝分裂前期进入细胞核内, 呈现类纺锤体式定位呈现类纺锤体式定

21、位, 并在并在细胞分裂过程中可观察到与细胞分裂过程中可观察到与DNA结合。结合。3、DNMT2 (1998年年)结构研究表明：结构研究表明：DNMT2序列与原核生物序列与原核生物DNA甲基转移酶高度同源；甲基转移酶高度同源；缺乏缺乏N-末端活性结构域末端活性结构域, 包括包括391个氨基酸个氨基酸, 大小约为大小约为40 kDa, 含有含有10个高度保守个高度保守DNA甲基转移酶基因序列；甲基转移酶基因序列；在在motif -区有区有41个保守的氨基酸个保守的氨基酸,其中包其中包Cys-Phe -Thr三肽和三肽和Asp-Ile二肽二肽, 这个区域与原核生物这个区域与原核生物DNA甲甲基转移酶

22、的基转移酶的TRD结构域相一致。结构域相一致。在组织内在组织内, DNMT2 表达广泛表达广泛, 主要存在于肌肉、发育中的胚胎内脏、主要存在于肌肉、发育中的胚胎内脏、卵巢囊肿以及增殖中的睾丸细胞。卵巢囊肿以及增殖中的睾丸细胞。DNMT2的功能性底物为的功能性底物为RNA分子分子, tRNAAsp是其主要靶标是其主要靶标, 它能够它能够特异性甲基化特异性甲基化tRNAAsp反密码子环反密码子环38C，这个功能具有高度的保守，这个功能具有高度的保守性。性。人们对人们对DNMT2功能的认识一直存在争议。目前研究认为它的功能的认识一直存在争议。目前研究认为它的DNA甲甲基化酶活性可能非常弱基化酶活性可

23、能非常弱, 而且识别位点并非而且识别位点并非CpG, 因而在体外酶活性因而在体外酶活性实验中实验中, 常常难以观测到常常难以观测到DNA甲基化酶活性。甲基化酶活性。在果蝇胚胎中的研究证实在果蝇胚胎中的研究证实, DNMT2的作用位点主要是的作用位点主要是CpT 和和CpA, 其其过表达将导致基因组显著高甲基化。过表达将导致基因组显著高甲基化。DNMT2的的C79A、E119A、R160A和和R162A位点是位点是DNMT2催化活性所催化活性所必需的必需的, 而它们与其他而它们与其他DNMTs相应位点具有高度的一致性，所以，认相应位点具有高度的一致性，所以，认为为DNMT2和和DNMT1、DNM

24、T3a、DNMT3b的催化机制极其类似。的催化机制极其类似。3、DNMTs家族成员及其结构家族成员及其结构三、三、DNMTs的功能的功能1、DNMTs与基因表达与基因表达一般认为一般认为DNA甲基化通过两种途径抑制基因表达甲基化通过两种途径抑制基因表达:直接阻碍转录因子与甲基化的直接阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合岛结合, 直接抑制基因表达；直接抑制基因表达；通过招募通过招募DNA甲基结合蛋白甲基结合蛋白(Methyl-CpG-binding proteins, MBP)及一些阻碍复合物及一些阻碍复合物, 阻止转录因子与特定阻止转录因子与特定DNA 序列结合序列结合, 间接抑制基因表达。间接

25、抑制基因表达。DNMT的基因表达抑制作用与组蛋白修饰和染色质重塑相关的基因表达抑制作用与组蛋白修饰和染色质重塑相关DNMTs与组蛋白修饰与组蛋白修饰相关因子的相互作用相关因子的相互作用是是 DNMT 调控基因表调控基因表达的重要手段。达的重要手段。DNMT1的的 N 端可与端可与 HDAC1、HDAC2 结结合，合，DNMT3a 、DNMT3b 也可招募也可招募 HDAC，从而使组蛋，从而使组蛋白去乙酰化；白去乙酰化；DNMTs还与组蛋白甲基化相关。还与组蛋白甲基化相关。DNMT1的的N端可以招募组蛋白甲基端可以招募组蛋白甲基化酶化酶Suv39h1 (Suppressor of variega

26、tion 3-9 homolog 1)和识和识别别HP1 (Heterochromatin protein 1)；Dnmt3a也可与能识别甲基化也可与能识别甲基化组蛋白的组蛋白的HP1和能直接识别对称甲和能直接识别对称甲基化组蛋的基化组蛋的H4R3me2s (Symmetric methylation of histone H4 arginine 3)相互作用。相互作用。DNMT1的的N端可以识别端可以识别DNA甲基结合蛋白甲基结合蛋白MBP家族中的家族中的MBD1 (Methyl-CpG binding domain 1)、MBD3、MeCP2 (Methyl-CpG binding pro

27、tein 2)，DNMT通过招募这些蛋白通过招募这些蛋白, 与组蛋白修饰和染色体重与组蛋白修饰和染色体重塑共同作用塑共同作用, 间接抑制基间接抑制基因表达。因表达。DNMT间接的基间接的基因沉默作用还表因沉默作用还表现在与一些共抑现在与一些共抑制子的相互作用制子的相互作用上。如上。如DNMT3a可以与一种转录可以与一种转录抑制蛋白抑制蛋白RP58结结合合, 二者共同抑制二者共同抑制基因表达。基因表达。抑制基因表达抑制基因表达DNMT3b在在HeLa细胞中细胞中可以与共抑制子可以与共抑制子SIN3A (Kinetochore associated protein)相互作用相互作用, 同时同时也可

28、与驱动蛋白也可与驱动蛋白KIF4A (Kinesin family member 4A)和凝缩蛋白和凝缩蛋白（condensin）相互作用）相互作用参与染色质浓缩。参与染色质浓缩。DNMT与相关蛋白的相互作用也与相关蛋白的相互作用也是是DNMT参与组蛋白修饰、染色参与组蛋白修饰、染色体变构的途径体变构的途径一些研究表明一些研究表明 DNMT 与基因沉默相关因子与基因沉默相关因子 PcG（Polycomb group）可相互作用。主要通过）可相互作用。主要通过PcG 蛋白组成的多聚复合物蛋白组成的多聚复合物 PRC（Polycomb repressive complexes）2 和和 3 中的中

29、的 EZH2 与与 DNMT 相互作用，共同抑制基因的表达。相互作用，共同抑制基因的表达。最近的一项研究中最近的一项研究中, 小鼠小鼠LSD1 的编码基因的编码基因Aof 2被敲除后被敲除后DNA甲基化水平下降甲基化水平下降, DNMT1水平下降。组蛋白甲基化酶水平下降。组蛋白甲基化酶SET7 也可调控也可调控DNMT1的稳定性，的稳定性，SET7通过直接与通过直接与DNMT1相互作用相互作用, 并特异地甲基化并特异地甲基化DNMT1的第的第142位赖氨酸位赖氨酸, 实现实现其对其对DNMT1数量和活性的抑制作用。数量和活性的抑制作用。因此，这些因子可以通过调控因此，这些因子可以通过调控DNM

30、T的的数量和活性间接参与基数量和活性间接参与基因沉默因沉默, 同时同时DNMT也通过这些因子参与其他水平的基因表达也通过这些因子参与其他水平的基因表达调控作用。调控作用。DNMTs将基因启动子区的将基因启动子区的DNA甲基化也是抑制基因表达最甲基化也是抑制基因表达最常见的表观遗传现象之一常见的表观遗传现象之一 。启动子区发生甲基化后，甲基基团本身以及甲基化启动子区发生甲基化后，甲基基团本身以及甲基化DNA募募集的甲基化结合蛋白，如集的甲基化结合蛋白，如MeCP2，所造成的空间位阻能够，所造成的空间位阻能够抑制转录因子的结合。此外，抑制转录因子的结合。此外，MeCP2可以募集组蛋白去乙可以募集组

31、蛋白去乙酰化酶酰化酶( HDAC) 的结合，使甲基化的结合，使甲基化DNA附近的组蛋白发生附近的组蛋白发生去乙酰化，形成较为紧密的染色质构象从而抑制转录。去乙酰化，形成较为紧密的染色质构象从而抑制转录。原理：原理：2、DNMTs与基因印记与基因印记基因印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给基因印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了某种修饰子代时发生了某种修饰, 这种作用使其后代仅表达父源或母源等位这种作用使其后代仅表达父源或母源等位基因的一种。基因的一种。迄今迄今, 在哺乳动物中已经发现的印记基因大约有在哺乳动物中已经发现的印记基因大约有70多种多种

32、, 其表达控其表达控制着胚胎的发生、发育过程。制着胚胎的发生、发育过程。与胚胎发育相关的与胚胎发育相关的DNMTs主要包括主要包括3种种: DNMT1o、DNMT3a2、DNMT3L。在发育早期在发育早期, DNMT1o 是维持印记基因甲基化形式的主要酶之一。是维持印记基因甲基化形式的主要酶之一。它在卵细胞它在卵细胞1、4细胞阶段存在于胞浆中细胞阶段存在于胞浆中, 8 细胞阶段则转移入核内。细胞阶段则转移入核内。胚泡植入后胚泡植入后, DNMT1o 则被则被DNMT1s取代。取代。DNMT3L缺乏酶活性缺乏酶活性, 然而却是卵细胞从头甲基化所必需的然而却是卵细胞从头甲基化所必需的, DNMT3

33、L 缺乏引起不孕。缺乏引起不孕。3、DNMTs与与基因组不稳定性基因组不稳定性基因组不稳定包括基因组不稳定包括DNA序列改变序列改变, 非整倍体性非整倍体性, 染色体易位染色体易位, 基因基因拷贝数增加等。拷贝数增加等。DNMTs可能从以下几个方面影响基因组稳定性：可能从以下几个方面影响基因组稳定性：(1) 影响端粒的完整性影响端粒的完整性可能与可能与DNMTs对非对非CpG位点的甲基化有关。而在位点的甲基化有关。而在 DNMTs缺陷的胚胎干细胞中缺陷的胚胎干细胞中, 这种甲基化修饰明这种甲基化修饰明显减少显减少, 导致端粒重组增多导致端粒重组增多, 主要表现为姐妹染色主要表现为姐妹染色体交换

34、增多和端粒长度不一体交换增多和端粒长度不一(2) 影响转座元件的活性影响转座元件的活性当环境或其他因素导致当环境或其他因素导致DNMTs活性降低时活性降低时, 基因组出基因组出现低甲基化状态现低甲基化状态, 甲基化不足引起众多转座元件的激甲基化不足引起众多转座元件的激活活, 从而出现基因组不稳定从而出现基因组不稳定(3) 影响影响DNA错配修复系统错配修复系统(MMR)的效率的效率DNMT1的丧失可能阻碍的丧失可能阻碍DNA复制复制相关的相关的MMR进程进程, 从而导致从而导致MMR效率的下降效率的下降4、DNMTs与与染色质修饰体系染色质修饰体系组蛋白去乙酰化酶组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是

35、组蛋白修饰体系中的一个重要成份是组蛋白修饰体系中的一个重要成份, 转录抑制复合物转录抑制复合物DNMTs/HDAC或或MBP/HDAC参与沉默各种组织参与沉默各种组织特异性基因和印记基因。特异性基因和印记基因。参与参与polycomb 蛋白蛋白(PcG)作用过程作用过程通过通过DNMTs保守的保守的PHD结构结构, DNMT3a、DNMT1均能与均能与H3K9甲基转移酶甲基转移酶SUV39H1以及以及SUV39H1结合伴侣结合伴侣HP1结合结合, 影影响它们甲基化响它们甲基化H3K9的活性的活性, 并对并对H3K4甲基化也可能产生影甲基化也可能产生影响。此外响。此外, DNMT1 能与能与hS

36、NF2H 染色质重塑酶结合染色质重塑酶结合, 高亲和高亲和力结合力结合DNA 底物。底物。5、DNMTs与与疾病疾病DNMTs异常可能通过异常可能通过3种方式改变种方式改变DNA甲基化模式而导致疾病甲基化模式而导致疾病:正常情况下高甲基化的正常情况下高甲基化的CpG岛出现低甲基化或未甲基化岛出现低甲基化或未甲基化的的CpG岛出现高甲基化岛出现高甲基化, 从而引起某些基因不正确地激活从而引起某些基因不正确地激活或沉默；或沉默；印记基因失调影响机体生长发育印记基因失调影响机体生长发育, 与一些先天性疾病有关；与一些先天性疾病有关；DNMTs功能缺陷引起基因组不稳定。功能缺陷引起基因组不稳定。DNM

37、Ts与与DNA高甲基化高甲基化现在认为，肿瘤细胞具有以下特征现在认为，肿瘤细胞具有以下特征: 逃避细胞死亡逃避细胞死亡 (resisting cell death)对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感( evading growth suppressors)诱导新血管生成诱导新血管生成( inducingangiogenesis) 无限的复制潜能无限的复制潜能(enabling replicative immortality)组织浸润和转移组织浸润和转移 (activating invasionandmetastasis) 持续的增殖信号持续的增殖信号(sustaining prolife

38、rativesignaling)能量代谢的改变能量代谢的改变(reprogrammingof energy metabolism)逃避免疫系统的破坏逃避免疫系统的破坏 ( evading immunedestruction)近年来近年来的研究的研究发现，发现，特定基特定基因的因的DNA高高甲基化甲基化在这些在这些过程中过程中均发挥均发挥重要作重要作用。用。逃避细胞死亡逃避细胞死亡通常情况下，细胞在接触抑制辐射凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，但是通常情况下，细胞在接触抑制辐射凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，但是癌细胞却可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖。癌细胞却可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖

39、。p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细胞发生凋亡，基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细胞发生凋亡，50%的癌的癌症中存在症中存在p53基因的突变失活。基因的突变失活。p53基因编码区的甲基化状态容易因为脱基因编码区的甲基化状态容易因为脱氨基作用发生氨基作用发生5mC -T的转换。同时，的转换。同时，INK4a/ARF抑癌基因启动子区域的抑癌基因启动子区域的甲基化可以使甲基化可以使p14 ARF表达下降，导致原来受表达下降，导致原来受p14 ARF抑制的抑制的MDM2表达表达上升，上升，MDM2 进而结合进而结合p53并使后者发生蛋白质水平的降解，使细胞逃避并使后者发生蛋白质水平的

40、降解，使细胞逃避p53引起的凋亡。引起的凋亡。BCL-2相关蛋白相关蛋白BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体，可以诱，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体，可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋导细胞在缺氧情况下发生凋 亡。亡。 BNIP3启动子区域包含启动子区域包含CpG岛，细胞恶变岛，细胞恶变时时BNIP3 启动子区高甲基化引起启动子区高甲基化引起BNIP3表达沉默，导致细胞逃避缺氧时的表达沉默，导致细胞逃避缺氧时的凋亡。凋亡。举例：举例：对生长抑制信号不敏感对生长抑制信号不敏感细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制，其中由细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制，其中由pRb参

41、与的参与的G1/S检测点调控尤其重要。检测点调控尤其重要。 未磷酸化的未磷酸化的pRb与与E2F结合，阻止细胞从结合，阻止细胞从G1期进入期进入S期。期。正常情况下正常情况下p16蛋白与蛋白与CDK4/6结合，阻止结合，阻止CDK复合物与周期蛋白复合物与周期蛋白D结合，结合，使使pRb不能磷酸化。不能磷酸化。p16基因的启动子区域甲基化后，其表达被抑制，使得基因的启动子区域甲基化后，其表达被抑制，使得p16蛋白依赖的蛋白依赖的TGF-生长抑制信号通路失去作用。生长抑制信号通路失去作用。调控机制：调控机制：新血管的生成是癌症发生中重要的步骤。新血管的生成是癌症发生中重要的步骤。诱导新血管生成诱导

42、新血管生成血小管反应蛋白血小管反应蛋白1( thrombospondin-1，TSP1) 是另一个抑制血管生成是另一个抑制血管生成的蛋白，的蛋白，TSP1基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制，进而导致肿瘤基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制，进而导致肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成。发生过程中细胞外基质重构和血管生成。新血管生成首先需要金属蛋白酶新血管生成首先需要金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMP)分解分解细胞外基质，再通过血管内皮生长因子细胞外基质，再通过血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VE

43、GF) 来诱导血管生成。来诱导血管生成。组织金属蛋白酶抑制剂组织金属蛋白酶抑制剂3( metalloproteinase inhibitor 3，TIMP3) 可以抑可以抑制金属蛋白酶的活性，同时与制金属蛋白酶的活性，同时与VEFGR2结合阻止血管生成。肿瘤细胞中启结合阻止血管生成。肿瘤细胞中启动子区域的甲基化引起部分动子区域的甲基化引起部分TIMP3的下调，从而导致心血管生成。的下调，从而导致心血管生成。无限的复制潜能无限的复制潜能癌细胞无限的复制潜能主要与端粒酶活性的升高有关。癌细胞无限的复制潜能主要与端粒酶活性的升高有关。端粒酶的重要组成部分人端粒酶逆转酶端粒酶的重要组成部分人端粒酶逆转

44、酶 (human telomerase reverse transcriptase，hTERT) 的活性与端粒酶活性高度相关，且的活性与端粒酶活性高度相关，且hTERT的激的激活依赖于启动子区域的甲基化。活依赖于启动子区域的甲基化。端粒酶可以利用端粒酶可以利用RNA逆转录逆转录DNA，解决，解决DNA复制时末端缺失的问题。复制时末端缺失的问题。正常情况下端粒酶只有在受精卵和干细胞中才有活性，而肿瘤细胞大正常情况下端粒酶只有在受精卵和干细胞中才有活性，而肿瘤细胞大多具有高活性的端粒酶。多具有高活性的端粒酶。组织的浸润和转移组织的浸润和转移组织浸润和转移是细胞恶变的重要特征。组织浸润和转移是细胞恶

45、变的重要特征。正常情况下，由正常情况下，由a-连环蛋白连环蛋白(a-catenin) 把把 -连环蛋白和连环蛋白和E-cadherin固定到固定到胞内肌动蛋白纤维上来加固细胞连接，胞内肌动蛋白纤维上来加固细胞连接， 转移的癌细胞转移的癌细胞E-cadherin普遍表普遍表达下降。达下降。 研究发现，研究发现，E-cadherin表达下降是通过启动子区域的甲基化来表达下降是通过启动子区域的甲基化来实现的。实现的。KiSS-1是近年发现的一个重要的肿瘤转移抑制基因，它可能通过抑制是近年发现的一个重要的肿瘤转移抑制基因，它可能通过抑制IV型型胶原酶和促进胶原酶和促进E-cadherin表达来抑制肿瘤

46、转移。启动子甲基化所导致的表达来抑制肿瘤转移。启动子甲基化所导致的KiSS-1表达抑制在胃癌、膀胱癌、肝癌的转移中都有重要的作用。表达抑制在胃癌、膀胱癌、肝癌的转移中都有重要的作用。抑癌基因抑癌基因LZTS1的启动子甲基化所导致的表达下降与乳腺癌的淋巴结转的启动子甲基化所导致的表达下降与乳腺癌的淋巴结转移相关。乳腺癌相关基因移相关。乳腺癌相关基因 DFNA5可以促进细胞凋亡，而可以促进细胞凋亡，而DFNA基因启动基因启动子甲基化后的表达抑制导致了肿瘤细胞转移几率增大。子甲基化后的表达抑制导致了肿瘤细胞转移几率增大。K-RAS/BRAF下游的下游的CDKN2A，RASSF1A和和RAR 等基因的

47、启动子甲基等基因的启动子甲基化使得这些基因的表达下降，导致化使得这些基因的表达下降，导致EGFR通路的过度激活，促进结肠癌通路的过度激活，促进结肠癌的转移。的转移。持续的增殖信号持续的增殖信号SFRPs基因家族编码基因家族编码Wnt 通路的抑制蛋白，但在通路的抑制蛋白，但在 在结直肠在结直肠癌中发现肿瘤干细胞中癌中发现肿瘤干细胞中SFRPs的启动子区域的高甲基化使的启动子区域的高甲基化使其表达抑制，引起了其表达抑制，引起了Wnt 通路的过度激活而刺激细胞分裂，通路的过度激活而刺激细胞分裂，因而细胞在不需要外界生长刺激因子的作用下就可以不断因而细胞在不需要外界生长刺激因子的作用下就可以不断增殖。

48、增殖。大部分的癌细胞不需要外界的生长刺激因子的作用就可以大部分的癌细胞不需要外界的生长刺激因子的作用就可以完成增殖，是因为细胞内的信号转导通路发生了变化，导完成增殖，是因为细胞内的信号转导通路发生了变化，导致促增殖因子作用的增强。致促增殖因子作用的增强。 DNMTs与与DNA低（去）甲基化低（去）甲基化特定基因特定基因( 主要是原癌基因主要是原癌基因) 的低甲基化的低甲基化基因组范围内以非编码重复序列为主的基因组范围内以非编码重复序列为主的DNA整整体水平的低甲基化体水平的低甲基化特定基因特定基因( 主要是原癌基因主要是原癌基因) 的低甲基化的低甲基化CT ( cancer/testis an

49、tigen genes) 抗原属于抗原属于MAGE( melanoma and germcell expressed) 基因家族，正常情况下只在生殖细胞表达。基因家族，正常情况下只在生殖细胞表达。 但发现但发现CT抗原也在多种抗原也在多种肿瘤组织中高表达，如肺癌、肿瘤组织中高表达，如肺癌、 胰腺癌、胰腺癌、 睾丸癌、睾丸癌、 胃癌、卵巢癌及子宫颈等。胃癌、卵巢癌及子宫颈等。 CT激活与它的启动子区域的去甲基化相关。激活与它的启动子区域的去甲基化相关。 胚系基因胚系基因MAGE（肿瘤抗原基因）在正常组织细胞中不表达，但在转移的肿瘤（肿瘤抗原基因）在正常组织细胞中不表达，但在转移的肿瘤细胞中，细胞

50、中，MAGE基因启动子区域的基因启动子区域的CpG岛异常低甲基化，促使岛异常低甲基化，促使MAGE基因表达。基因表达。MUC3A是一种膜结合的糖蛋白，与乳腺癌、肺癌、胰腺癌和直肠癌的预是一种膜结合的糖蛋白，与乳腺癌、肺癌、胰腺癌和直肠癌的预后不良有关。后不良有关。 研究表明，研究表明，MUC3A在肿瘤中的表达上调也是启动子区域的在肿瘤中的表达上调也是启动子区域的低甲基化引起的。低甲基化引起的。近年来，在肉瘤近年来，在肉瘤( FGFR基因基因)、白血病、白血病 (PRAME基因基因)、 霍奇金霍奇金 淋淋 巴巴 瘤瘤 (CD30 基基 因因 )、乳、乳 腺腺 癌癌 (NAT1 基因基因)、结肠直

51、肠癌、结肠直肠癌(IGF2基因基因)、 乳腺癌和直肠腺癌乳腺癌和直肠腺癌 (gamma-globin基基 因因)、肾、肾 细细 胞胞 癌癌 (MN/CA9基因基因)、和肝癌、和肝癌(c-MYC基因基因) 中都中都发现了由启动子低甲基化所引起的肿瘤相关基因的过表达。发现了由启动子低甲基化所引起的肿瘤相关基因的过表达。基因组范围整体基因组范围整体DNA甲基化的降低甲基化的降低在多种癌症当中都发现了基因组范围整体水平的在多种癌症当中都发现了基因组范围整体水平的DNA甲基化降低，包括许甲基化降低，包括许多重复序列甲基化水平的下降。正常组织细胞的甲基胞嘧啶含量约多重复序列甲基化水平的下降。正常组织细胞的

52、甲基胞嘧啶含量约4%，而癌细胞则为大约而癌细胞则为大约2%3%。DNA重复序列的去甲基化可能通过以下途径参与肿瘤的发生和进展：重复序列的去甲基化可能通过以下途径参与肿瘤的发生和进展：影响染色体稳定性和基因组完整性影响染色体稳定性和基因组完整性影响重复序列的表达影响重复序列的表达在小鼠胰腺导管上皮癌的细胞中，发现了卫星在小鼠胰腺导管上皮癌的细胞中，发现了卫星DNA异常高表达，而这种异常高表达，而这种现象在肺肾卵巢直肠中也有发现，包括卫星现象在肺肾卵巢直肠中也有发现，包括卫星DNA、 HSATII、 LINE-2等。等。DNADNA甲基化转移酶抑制剂甲基化转移酶抑制剂 DNA甲基化由甲基化由DNA

53、甲基转移酶催化发生甲基转移酶催化发生,是真核细胞是真核细胞DNA正常的表观遗传学修饰方式正常的表观遗传学修饰方式,但异常甲基化常导致肿但异常甲基化常导致肿瘤的发生瘤的发生 ,以地西他滨为代表的以地西他滨为代表的DNA甲基转移酶抑制剂是甲基转移酶抑制剂是一类甲基化调节剂一类甲基化调节剂 ,能通过对抑癌基因去甲基化调节达到能通过对抑癌基因去甲基化调节达到治疗肿瘤的目的治疗肿瘤的目的.DNA异常甲基化可分为异常甲基化可分为DNA高甲基化和高甲基化和低甲基化低甲基化 , 抑癌基因启动子的过度甲基化能使抑癌基因表抑癌基因启动子的过度甲基化能使抑癌基因表达下调或失活达下调或失活,导致肿瘤的发生导致肿瘤的发

54、生,已成为肿瘤发生机制的研已成为肿瘤发生机制的研究热点之一究热点之一 。甲基化抑制剂可以使。甲基化抑制剂可以使DNA去甲基化去甲基化,恢复抑恢复抑癌基因的表达癌基因的表达,治疗肿瘤。治疗肿瘤。 核核 苷苷 类类非核苷类非核苷类是一类以胞嘧啶核苷为原型的衍生物是一类以胞嘧啶核苷为原型的衍生物, 其作用机制是在其作用机制是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷, 在在DNA复制过程中复制过程中代替胞嘧啶代替胞嘧啶,其与其与DNMT具有很强的结合力具有很强的结合力, 竞争性抑制竞争性抑制DNMT活性活性, 阻断甲基化反应。阻断甲基化反应。DNA甲基化转移酶抑制剂甲基化转移酶抑

55、制剂不含胞嘧啶核苷结构不含胞嘧啶核苷结构,一部分是在传统药物的临床试验一部分是在传统药物的临床试验 和应用中发现其去甲基化功能的和应用中发现其去甲基化功能的,机制不完全明确机制不完全明确 ,可可能与干扰能与干扰DNMT有关有关;另一部分是针对另一部分是针对 DNMT结构设计结构设计的特异性抑制剂。的特异性抑制剂。分类分类核苷类核苷类其他核苷类其他核苷类5-5-氟氟2-2-脱氧核苷脱氧核苷 法扎拉滨法扎拉滨 二氢二氢-5-5-氮杂胞苷氮杂胞苷阿扎胞苷阿扎胞苷地西他滨地西他滨折布拉林折布拉林DNA甲基化转移酶抑制剂甲基化转移酶抑制剂 本品为胞嘧啶核苷类药物，能直接掺入本品为胞嘧啶核苷类药物，能直接

56、掺入DNADNA中，抑制中，抑制DNADNA和和RNARNA合成，可杀伤处于合成，可杀伤处于S S期的细胞。由阿糖胞苷合成的一种胞嘧啶核苷期的细胞。由阿糖胞苷合成的一种胞嘧啶核苷衍生物衍生物 , ,能参与能参与DNADNA的合成的合成 , ,通过抑制通过抑制 DNMT,DNMT,阻断甲基化反应中的阻断甲基化反应中的中间步骤中间步骤 , ,导致细胞的基因组导致细胞的基因组DNADNA去甲基去甲基 。阿扎胞苷阿扎胞苷DNA甲基化转移酶抑制剂核苷类甲基化转移酶抑制剂核苷类Pharmion公司开发公司开发，用于，用于治疗治疗骨髓增生异常综合征骨髓增生异常综合征，2004年上市年上市。 以以地西他滨地西

57、他滨为代表的核苷类去甲基化药物是目前研究最多也是机为代表的核苷类去甲基化药物是目前研究最多也是机制最明确的一类甲基化抑制剂制最明确的一类甲基化抑制剂, ,较较阿扎胞苷阿扎胞苷等药物更稳定等药物更稳定, , 疗效更确疗效更确切切, , 且能治疗对阿扎胞苷等不敏感的肿瘤且能治疗对阿扎胞苷等不敏感的肿瘤, , 特别是在血液系统肿瘤的特别是在血液系统肿瘤的治疗中广泛应用治疗中广泛应用. . 治疗治疗骨髓增生异常综合征骨髓增生异常综合征，慢性粒细胞白血病慢性粒细胞白血病，2006年上市年上市。地西他滨地西他滨DNA甲基化转移酶抑制剂核苷类甲基化转移酶抑制剂核苷类 折布拉林折布拉林是另一种胞苷类似物是另一

58、种胞苷类似物SCOTT等，将折布打林作用于白血等，将折布打林作用于白血病细胞株病细胞株193使肿瘤抑制基因使肿瘤抑制基因 p15INK4BCpG岛去甲基化并表达增岛去甲基化并表达增加加,使细胞增殖停滞在使细胞增殖停滞在2 / 期期,并诱导细胞凋亡。并诱导细胞凋亡。 用于治疗用于治疗肿瘤肿瘤，现处于，现处于临床期研究临床期研究。折布拉林折布拉林DNA甲基化转移酶抑制剂核苷类甲基化转移酶抑制剂核苷类其他核苷类其他核苷类5-5-氟氟2-2-脱氧核苷脱氧核苷 针对阿扎胞苷和地西他滨化学稳定性不足而针对阿扎胞苷和地西他滨化学稳定性不足而设计的。设计的。法扎拉滨法扎拉滨 由于其治疗应答率均较低已基本停止使用。由于其治疗应答率均较低已基本停止使用。二氢二氢-5-5-氮杂胞苷氮杂胞苷 是在阿扎胞苷是在阿扎胞苷5,65,6位打开亚胺基双键而位打开亚胺基双键而得到的得到的, ,较阿扎胞苷稳定较阿扎胞苷稳定, ,去甲基化作用较阿扎胞苷和地西他去甲基化作用较阿扎胞苷和地西他滨缓和。滨缓和。5-氟脱氧胞苷氟脱氧胞苷用于抗肿瘤用于抗肿瘤 现处于一期临床现处于一期临床 DNA甲基化转移酶抑制剂核苷类甲基化转移酶抑制剂核苷类非核苷类非核苷类氨基苯甲酸类氨基苯甲酸类茶多酚类茶多酚类肼类肼类邻苯二酰胺类邻苯二酰胺类反义寡核苷酸类反义寡核苷酸类其他其他 三氧化二砷三氧化二