色谱液相色谱高效液相色谱

1、 第十一章第十一章 色谱法基础色谱法基础 Chromatography4概述概述 色谱法又称色层法或层析法。色谱法又称色层法或层析法。 *色谱法是一种物质的分离方法。在色谱法是一种物质的分离方法。在1903年，年，俄植物学家俄植物学家Michail Tswett在研究植物色素的在研究植物色素的成分时，在一根玻璃管中填上碳酸钙颗粒，然成分时，在一根玻璃管中填上碳酸钙颗粒，然后把植物叶的石油醚提取液加在柱中，这时色后把植物叶的石油醚提取液加在柱中，这时色素便被碳酸钙柱吸附在柱的顶端上。素便被碳酸钙柱吸附在柱的顶端上。 *然后继续加入石油醚，使其自由流下，这时然后继续加入石油醚，使其自由流下，这时植

2、物色素在碳酸钙柱内下移，并逐渐分离成不植物色素在碳酸钙柱内下移，并逐渐分离成不同颜色的色带。同颜色的色带。*这种分离植物色素的方法即这种分离植物色素的方法即被称为被称为色谱法色谱法。层析法(色谱法)分离物质的方法之一分离物质的方法之一:离心离心分离物质的方法之一分离物质的方法之一:过滤过滤蒸馏蒸馏分馏分馏萃取萃取 *这支填有碳酸钙（填充剂）的玻璃管被称为这支填有碳酸钙（填充剂）的玻璃管被称为色谱柱色谱柱。 *玻璃管内的填充物（如玻璃管内的填充物（如CaCO4颗粒）即称为颗粒）即称为固定相固定相。 *流经固定相的孔隙或表面的溶剂（如上述提到的石油流经固定相的孔隙或表面的溶剂（如上述提到的石油醚）

3、称醚）称流动相流动相。 色谱柱：色谱柱：Chromatographic column HPLC column GC Capillary column 固定相：固定相：Stationary phase 流动相：流动相：Mobile phase *现代，关于色谱法、固定相和流动相以及色谱现代，关于色谱法、固定相和流动相以及色谱本身的概念已有了很大的发展。本身的概念已有了很大的发展。 *其它的分离方法：蒸馏，升华，结晶，溶剂萃其它的分离方法：蒸馏，升华，结晶，溶剂萃取，化学沉淀法等等。取，化学沉淀法等等。 *与以上这些方法相比，色谱法的分离效果更好，与以上这些方法相比，色谱法的分离效果更好，效率更高

4、。很多物理、化学性质很相近的化合物效率更高。很多物理、化学性质很相近的化合物都可以采用色谱法进行分离、分析与测定。目前，都可以采用色谱法进行分离、分析与测定。目前，可以说几乎在所有领域都有色谱分析法的应用。可以说几乎在所有领域都有色谱分析法的应用。4色谱分析方法的分类色谱分析方法的分类 在色谱分析法中，流动相可以是气体或液化，而在色谱分析法中，流动相可以是气体或液化，而固定相一般为固体或液体。固定相一般为固体或液体。 流动相流动相液体或气体液体或气体 固定相固定相固体或液体固体或液体 *当固定相和流动相是两种互不相溶的液体时，这当固定相和流动相是两种互不相溶的液体时，这种分离方法就叫液种分离方

5、法就叫液-液色谱法。液色谱法。 *如果固定相是固体，而流动相是液体，则称为液如果固定相是固体，而流动相是液体，则称为液-固（或吸附）色谱法。固（或吸附）色谱法。 *还可按固定相的使用形式分类：还可按固定相的使用形式分类： A、柱层析柱层析 B、纸层析纸层析 C、薄层层析薄层层析 薄层层析法薄层层析法4色谱分离过程的原理色谱分离过程的原理 色谱分离过程是利用试样中各组分在固定相等色谱分离过程是利用试样中各组分在固定相等流动相之间具有不同的分配常数，即具有不同流动相之间具有不同的分配常数，即具有不同的溶解和解析能力，或不同的吸附、脱附能力，的溶解和解析能力，或不同的吸附、脱附能力，或其它亲和性能的

6、差异。或其它亲和性能的差异。 *如：在柱层析过程中：如：在柱层析过程中： 假设：一个含有三种化合物的试样由流动相带假设：一个含有三种化合物的试样由流动相带入色谱柱中，并朝着流动相的方向往前移动。入色谱柱中，并朝着流动相的方向往前移动。由于各组分在固定相中的分配系数可吸附和脱由于各组分在固定相中的分配系数可吸附和脱附能力有差异，各组分在色谱柱中的移动速度附能力有差异，各组分在色谱柱中的移动速度不同。当移动一定的柱长之后，各组分即可得不同。当移动一定的柱长之后，各组分即可得到完整的分离。到完整的分离。色谱分离过程色谱分离过程4色谱图（色谱图（Chromatogram） 试样中各组分经色谱柱分离后，

7、随流动相依次试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次流出色谱柱进入检测器，检测器的响应信号随流出色谱柱进入检测器，检测器的响应信号随时间变化曲线或检测器的响应信号一流动相体时间变化曲线或检测器的响应信号一流动相体积曲线，称为色谱图。积曲线，称为色谱图。 *基线基线baseline 如果没有进样，只有流动如果没有进样，只有流动相在流动，得到的检测信号应是一条平稳的平相在流动，得到的检测信号应是一条平稳的平行于横坐标的直线，这条直线称为基线。行于横坐标的直线，这条直线称为基线。 *色谱峰色谱峰（Peak） 当试样中的组分经色谱当试样中的组分经色谱柱分离之后进入检测器时，得到的响应信号的柱分离之后进

8、入检测器时，得到的响应信号的大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰（Chromatographic peak）。）。色谱图 *正常的色谱峰为对称于峰尖的正态分布曲线。正常的色谱峰为对称于峰尖的正态分布曲线。 *峰底峰底峰的起点与终点连接线称为峰底。峰的起点与终点连接线称为峰底。 *峰高与峰面积峰高与峰面积色谱峰顶点与峰底之间的色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高（垂直距离称为峰高（Peak Height）。）。 （Peak Area）峰与峰底之间的面积称为峰面）峰与峰底之间的面积称为峰面积。积。 *半高峰宽（半高峰宽（peak width at ha

9、lf height）即色谱峰高一半处的峰宽，称为半高峰宽。即色谱峰高一半处的峰宽，称为半高峰宽。*峰宽峰宽自色谱峰两侧拐点处所作切线与峰自色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交于两点，此两点间的距离称为峰宽底相交于两点，此两点间的距离称为峰宽（Peak width）。）。 W = 1.7 W h/2*保留时间保留时间从进样开始到柱后被测组分出从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时所需的时间称为保留时间现浓度最大值时所需的时间称为保留时间（Retention time ），用），用tR表示。表示。 *保留体积保留体积从进样开始到柱后被测组分出现从进样开始到柱后被测组分出现浓度最大值时流动相所通过的

10、体积称为保留体积。浓度最大值时流动相所通过的体积称为保留体积。VR表示。（表示。（Retention Volume） *死体积死体积不被固定相滞留的组分，从进样到不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需流动相的体积称为死体积出现峰最大值所需流动相的体积称为死体积（Dead Volume），用），用VM表示。所对应的保留表示。所对应的保留时间称为死时间。时间称为死时间。 VM = Tm Fc （Fc 体积流量）体积流量） *调整保留时间调整保留时间扣除死时间后的保留时间称扣除死时间后的保留时间称为调整保留时间（为调整保留时间（Adjust Retention Time） 用用t R 表示：

11、表示： t R = t R t M *调整保留体积调整保留体积扣除死体积后的保留体积称为扣除死体积后的保留体积称为调整保留体积，用调整保留体积，用V R表示。表示。 V R = V R V M *相对保留值相对保留值在相同操作条件下，组分与参比在相同操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比称为相对保留值（组分的调整保留值之比称为相对保留值（Relative Retention），用），用ris 表示：表示： ris = t R（i） / t R（s） = V R（t） / V R（s） *分配系数（分配系数（Partition Coeffcienr）：在一定温度）：在一定温度和压力下，组分在

12、固定相和流动相之间达到平衡时和压力下，组分在固定相和流动相之间达到平衡时的浓度比值，称为分配系数。即：的浓度比值，称为分配系数。即： K = Cs / CM K为分配系数，为分配系数， Cs ， CM 分别为组分分别为组分在固定相和流动相中的浓度。在固定相和流动相中的浓度。 *容量因子：在一定温度和压力下，组分在两相容量因子：在一定温度和压力下，组分在两相之间分配达到平衡时组分分配在固定相和流动相之间分配达到平衡时组分分配在固定相和流动相的质量比称为容量因子（的质量比称为容量因子（Capacity factor *柱效率与分辩率：柱的分离效率可以用柱效率与分辩率：柱的分离效率可以用effect

13、ive plate number “有效塔板数有效塔板数”来表示。来表示。 *Neff = L / H L柱长，柱长，H是塔板高度。是塔板高度。 *分辨率分辨率是指两个相邻峰的分离程度，用是指两个相邻峰的分离程度，用Rs表表示。示。 第十二章第十二章 气相色谱法气相色谱法（Gas Chromatography） 流动相流动相：气体；：气体；固定相固定相：固体、液体。：固体、液体。 特点：特点：选择性高（可以分离性质极为相近的选择性高（可以分离性质极为相近的 化合物）；化合物）； 高效（在较短时间内可以分离极为复高效（在较短时间内可以分离极为复 杂的化合物）杂的化合物） 灵敏度高（可检出灵敏度高

14、（可检出10-11 10-13 g的物的物 质）；质）； 分析速度快（几分钟到几十分钟）；分析速度快（几分钟到几十分钟）； 应用范围广（衍生化反应：难挥发应用范围广（衍生化反应：难挥发 挥发）。挥发）。汽油(GC-FID)4气相色谱仪气相色谱仪仪器构成仪器构成 高压钢瓶高压钢瓶减压阀减压阀载气净化干燥管载气净化干燥管流量流量计计压力表压力表进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器记录仪。记录仪。 载气载气（Carrier gas）流动相流动相 *通常在气相色谱法中被用作流动相的气体有氢气、通常在气相色谱法中被用作流动相的气体有氢气、氮气、氩气和氦气等。这些气体一般都由高压气瓶氮气、氩气和氦气等。这

15、些气体一般都由高压气瓶供给。供给。 *气相色谱对载气的纯度有一定的要求，如：气相色谱对载气的纯度有一定的要求，如：99.99%。 *不能含有氧气，因为在高温下，氧化可破坏所要分不能含有氧气，因为在高温下，氧化可破坏所要分析的化合物，氧化也可破坏气相色谱柱中的固定相。析的化合物，氧化也可破坏气相色谱柱中的固定相。 *因此，从钢瓶中出来的载气，必须先经过净因此，从钢瓶中出来的载气，必须先经过净化干燥和除氧等装置，再进入气相色谱系统。化干燥和除氧等装置，再进入气相色谱系统。*净化管净化管可用活性炭或分子筛，以去除载可用活性炭或分子筛，以去除载气中的烃类杂质。气中的烃类杂质。 *干燥管干燥管硅胶分子筛

16、（去除水分）。硅胶分子筛（去除水分）。 *去氧管去氧管如活性铁粉填充剂等。如活性铁粉填充剂等。 *载气的流速、压力应保持恒定，载气的管道载气的流速、压力应保持恒定，载气的管道系统应保持密闭、不漏气。系统应保持密闭、不漏气。 进样器进样器（Injector） 分流进样器分流进样器 Split Injector 分流进样器分流进样器毛细管毛细管 不分流进样器（不分流进样器（Splitless Injector）填充管填充管 气密性微量注射器气密性微量注射器 自动进样器自动进样器 进样量进样量12 l 气相色谱柱气相色谱柱： 填充柱填充柱用玻璃或不锈钢管做成。内径为用玻璃或不锈钢管做成。内径为1.6

17、 9.5 mm ,长度通常为长度通常为3m左右。左右。 *固定相有固体的液体固定相有固体的液体 *固体的固定相有：活性炭、硅胶、氧化铝和分子固体的固定相有：活性炭、硅胶、氧化铝和分子筛等筛等 *液体固定相有：涂在隋性载体颗粒表面上，液体液体固定相有：涂在隋性载体颗粒表面上，液体固定相有：甲基硅油等。固定相有：甲基硅油等。 *不同固定相，其用途及适合的温度范围也不同。不同固定相，其用途及适合的温度范围也不同。 毛细管柱毛细管柱fused silica 内径为内径为0.53 , 0.32 , 0.25mm，空心毛细管，内壁涂了一层很薄的固定，空心毛细管，内壁涂了一层很薄的固定相（液），厚度小于相（

18、液），厚度小于1 m至至2 m。 *毛细管柱的分离效率特别高。理论塔板数（毛细管柱的分离效率特别高。理论塔板数（10米长）可达几万以上。米长）可达几万以上。 气相色谱柱的温度控制气相色谱柱的温度控制oven（炉），程序升（炉），程序升温，降温，保温（温，降温，保温（ 1） 检测器（检测器（Detectors） 热导检测器（热导检测器（TCD） Thermal Conductivity Detector *由一根加热电阻丝构成，热丝的散热速度与由一根加热电阻丝构成，热丝的散热速度与周围气体的热传导效率有关。当只有载气通过周围气体的热传导效率有关。当只有载气通过时，热丝的散热速率保持恒定，热丝的温

19、度也时，热丝的散热速率保持恒定，热丝的温度也保持恒定。作为载气的氢气或氦气的热导率比保持恒定。作为载气的氢气或氦气的热导率比多数有机化合物的热导率高多数有机化合物的热导率高610倍，故当有被倍，故当有被测有机化合物通过时，热丝的温度就会升高，测有机化合物通过时，热丝的温度就会升高，其电阻就变大。其电阻就变大。 特点：非破坏性、通用（应用范围广）。特点：非破坏性、通用（应用范围广）。 缺点：灵敏度不高。缺点：灵敏度不高。 火焰离子化检测器（火焰离子化检测器（FID） Flame ionigation detector 火焰离子化检测器主要由一氢气火焰组成。火焰离子化检测器主要由一氢气火焰组成。F

20、ID 氢火焰燃烧时产生离子与自由电子，在两极（电压氢火焰燃烧时产生离子与自由电子，在两极（电压差约为差约为400V）间可产生）间可产生10-12 A的电流。的电流。 当可产生电离的被分析化合物从色谱柱中进入火焰当可产生电离的被分析化合物从色谱柱中进入火焰时，便可产生大量离子与电子，使电流增大。时，便可产生大量离子与电子，使电流增大。 CH + O CHO+ + e- 自由基自由基 加热裂解加热裂解 FID信号大小与信号大小与CH2 的数目成正比。的数目成正比。 C O 则不产生信号。则不产生信号。H2O，CO， CO2，CS2，SO2，NH3，N2O，NO，NO2等气体不产生信号。等气体不产生

21、信号。 热离子发射检测器（热离子发射检测器（TED） Thermoionic Emission Detector 硅酸铷硅酸铷Rb2SiO3用于用于N，P和和S（氮、磷和硫）（氮、磷和硫）的测定。的测定。 *Bead of Rb2SiO3 的温度（的温度（600800）是）是由一加热电阻丝来控制。由一加热电阻丝来控制。 *H2和空气的流量很低，不足以形成火焰。但和空气的流量很低，不足以形成火焰。但H2可以在可以在Rb2SiO3 表面形成一暗红的等离子体表面形成一暗红的等离子体（Plasma）。）。 当当P，N或或S接触等离子体时，则产生电离作用，接触等离子体时，则产生电离作用，形成形成 e-

22、和和 p+ 离子，产生电流信号。离子，产生电流信号。 *该检测器可选择性（特异性）检测含该检测器可选择性（特异性）检测含N、P、S的化合物。的化合物。 灵敏度：灵敏度：10-13 10-14 g/N，S，P 火焰光度检测器火焰光度检测器含含P，S等有机物的测定。等有机物的测定。 *在火焰中（富在火焰中（富H2 ）,R-SH 被还原为被还原为S，R-PO3-变变为为HPO，并被激发到激发态，产生电磁发射，并被激发到激发态，产生电磁发射，S为为394nm，HPO为为526nm。灵敏度。灵敏度10-1110-12 g 光电离检测器（光电离检测器（ PID ） Photoionzation Detec

23、tor 利用高能的远紫外线使被测化合物产生电离作用，利用高能的远紫外线使被测化合物产生电离作用，产生产生M+ + e -，形成电流信号。，形成电流信号。 电子捕获检测器（电子捕获检测器（ECD） Electron Capture Detector *选择性高，灵敏度也高。主要用于含有高电负性选择性高，灵敏度也高。主要用于含有高电负性元素的化合物的测定。元素的化合物的测定。 如：含卤素（如：含卤素（F，Cl，Br，I）、）、S，P，N，O，对，对其它元素则没有响应。其它元素则没有响应。 *主要用于农药、主要用于农药、PCB等的检测。等的检测。 *载气如载气如N2或或He通过放射源通过放射源63N

24、i时，时， N2 + - N2+ + e *可产生大量的热电子，并形成稳定的电流，当带可产生大量的热电子，并形成稳定的电流，当带有电负性的化合物经过时，捕获了热电子，使电流有电负性的化合物经过时，捕获了热电子，使电流量减弱，产生负信号。如：量减弱，产生负信号。如： M + e- M- M- + N2+ N2M（无电荷）（无电荷） *GC-MS气质联用仪气质联用仪 *Van Deemter 方程方程 载气流速的选择：载气流速的选择： H = A + B/U + CU H塔板高，塔板高，U载气线速载气线速 A：涡流扩散项（：涡流扩散项（Eddy Diffusion） B/U：纵向分子扩散：纵向分子

25、扩散 CU：为传质阻力，：为传质阻力，mass transfer薄荷油 第十三章第十三章 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC） High Performance Liquid Chromatography 特点：特点：高效：理论塔板数高达上万高效：理论塔板数高达上万 高速：几分钟到几十分钟高速：几分钟到几十分钟 灵敏度高：紫外、荧光、电化学灵敏度高：紫外、荧光、电化学 自动化：电脑化自动化：电脑化 与气相色谱比较：对试样的沸点没有特殊要求，可与气相色谱比较：对试样的沸点没有特殊要求，可用于分离难挥发的物质，如用于分离难挥发的物质，如核酸、糖、蛋白质、多核酸、糖、蛋白质、多肽等肽等。可收集

26、从柱子流出的组分。可收集从柱子流出的组分。 流动相流动相： CHCl3氯仿氯仿 CH2Cl2 二氯甲烷二氯甲烷 四氢呋喃四氢呋喃 正已烷正已烷 丙醇丙醇 甲醇甲醇CH3OH 乙腈乙腈CH3CN 水或缓冲溶液水或缓冲溶液 *根据所分析的化合物的物理性质和分离的复根据所分析的化合物的物理性质和分离的复杂性，选择不同的色谱柱，再进一步确定流动杂性，选择不同的色谱柱，再进一步确定流动相的构成。相的构成。Varian 9010 Solvent Delivery System Rheodyne Injector %A %B %C Flow Rate PressureH2O MeOH (mL/min) (atmos.)ReadyTernary PumpACBfrom solvent reservoirColumnto detectorto columnthroughpulsedampenerto injectorthrough pumploadinject 高压泵高压泵（压力可达（压力可达6000psi） 螺旋推进压力泵（螺旋推进压力泵（Syringe Pump）注注射器式。射器式。 特点：压力稳定，流量稳定，可用于毛细管柱特点：压力稳定，流量稳定，可用于毛细管柱（流量低），以及