反向斑点杂交

1、核酸杂交技术根据检测目的和检测手段的不同，可分为液相杂交、固相杂 交及细胞内定位 （原位 ）杂交。固相杂交又可分为斑点杂交、凝胶电泳印迹转移杂 交。而反向斑点杂交（reverrsedotblot, RDB是Saiki等提出的一种斑点杂交技 术，该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感 性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面 有其独特的优势。1 检测原理反向斑点杂交工作原理，利用生物素等标记的探针和特意性扩增PCR产物（靶DNA序列）杂交。但是不同于一般的斑点杂交。一般的点印迹杂交是靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，标记的探针和靶 DNA

2、杂交显色。这种方法每 次杂交反映只能判断待测 DNA是否含有某一种探针的同源序列，对于某些基因 座位可能含有十几至几十个等位基因（如 HLADRB位点或地中海贫血突变基因 等），用这种点杂交方法就会很繁杂，甚至可能做不到。而RDB正是解决了这一难题。RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本（一般是经PCR特意性扩增的产物，在PCR引物5端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标 记有生物素 ）与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤 去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了 待测DNA的探针

3、点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出 杂交信号。这样一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此 利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。2 RDB检测RDB是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA又互不干扰，故能一次性筛查出多种不同的序列，而不是像传统的杂交法，一次仅能检 测一个未知序列。同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的 Tm 值。因此尽可能使设计的 探针Tm值变动在较小范围内。降低了假阳性率和假阴性率。本法操作安全、简 单、快捷，膜条植被时间较短，只需几小时，可大量

4、预先制备放于4C保存待用。PCRT增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜（实现了洗膜条件同一化，无需 不同洗膜条件）、显色、结果判定。应用凯普 HybrimaxDNA快速杂交仪使整个杂 交过程在1.5 h即可完成。既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同 时分型，具有敏感性高、特异性强、稳定性好的特点。3 应用范围由于RDB具有高灵敏性、高特异性和准确性好的特点，目前该项技术已被 用于病原体、肿瘤基因检测、病毒基因分型、基因突变以及多态性的研究等多 个领域。3.1 病原体检测应用RDB可以检出10 ng的细菌DNA，如对肺炎链球菌检出率高、敏感性 和特异性都很好1。RDB可用来鉴定临床常见

5、的8种医学真菌2。对沙 眼衣原体，在不能得到血清型抗体或者不能进行衣原体培养的情况下来检测标 本中存在的衣原体血清型，应用 RDB对衣原体检测是一项简便而有效的技术 3。3.2基因分型检测国内外常用的基因分型方法包括：限制性片段长度多态性（RFLP）序列特异性寡核苷酸探针（PCRSSOP）序列 特异性引物（PCRSSP）单链构象多态性（PCRSSCP）序列测定（DNASeguenee）这 些方法各有其优缺点。主要缺点是包括技术复杂、成本昂贵、效率低及分辨率 不足。而RDB却较上述方法显示了其优越性，有广泛的应用价值。3.2.1 RDB应用于人类白细胞抗原的分型检测HLA分子的多态性对于移植配型

6、和科研有十分重要的意义4。3.2.2用于人类乳头瘤病毒（HPV的基因分型HPV是已知少数DNA肿瘤病毒之一，在女性下生殖道肿瘤的检出率达到了 90%,文献报告有80种左右的基因型，DNA的检测和分型对女性生殖道肿瘤的 病因学和癌情预报具有重要意义。齐风菊等5人应用RDB用语HPV常见不 同型别的检测，使基因诊断程序大为简化，突现了对HPV的快速诊断。323 RDB用于丙型肝炎病毒(HCV分型目前HCV主要被划分为6种基因型。我国主要HCV基因型为1、2、6型，其分布呈南北地域差异，南方以 1b型为主，北方以2a型逐步 增多，香港有6种。HCV基因型无论是对HCV的基础研究、临床治疗还是预 防，

7、都有着重要意义。已知 HCV可分为11个基因性，80多个基因亚基，HCV 基因分型，唯一的参比标准是 HCV基因组测序。RDB技术最大的特点就是简 便、快速而分辨能力高,配合凯普快速杂交仪,可同时对多位点多基因序列进 行分析。3.3基因突变检测遗传病方面张基增等6设计了针对中国人18种突变的ASO探针，建立 起检测中国人B地贫突变的RDB法，迄今已成功地应用于40多个家系的产前诊 断。是目前国内多B地中海贫血诊断率最高的方法。RDB可检测苯丙酮尿症(PKU是基因突变，PKU主要是由于苯丙氨酸羟化酶 的基因突变造成的，PAH的突变不是随机分布的，各型分布的频率与地理位置 有一定关系。RDB对PA

8、H家族的新生儿可快速筛查出来7。RDB用于结核分枝杆菌rpob基因检测，结核分枝杆菌对抗结核一线药物利 福平的耐药发生率达90%以上。rpoB基因内少数密码子突变引起编码 RNA聚合 酶B亚基构象发生改变，失去结合利福平的能力，而导致耐药的发生。RDB可以同时在一张膜上检测出覆盖rpoB基因高频突变区的511位亮氨酸(Len)脯氨酸 (pro), 513位谷氨酰胺(G1 n)脯氨酸(pro), 516位天门冬氨酸(ASP缬氨酸(Vai), 526位组氨酸(His)天门冬氨酸(ASP) 531位丝氨酸(Ser)亮氨酸(Leu)突变。RDB用于乙型肝炎病毒(HBV)突变检测，可了解乙肝患者病毒发生

9、变异的状 况：女口 HBVYMDO野生型（株）感染；HBVYIDD型突变型感染；HBVYVDD突变型感 染；HBVYMDD野生型和 YIDD突变型混合感染；HBVYMDD和YVDD混和感染； HBVYMDD和YIDD及YVDD型混合感染。通过及时了解患者（尤其是拉米夫定治 疗者）病毒是否发生突变，有利指导临床用药，如发生突变继续用药无效，不仅 增加病人不必要的经济负担和造成社会资源的浪费，还可能存在严重的流行病 学危害 8。拉米夫定耐药性的产生主要是由病毒基因组变化引起的。近年来报道了Lamivudine治疗乙肝过程中产生的耐药突变主要集中在 552位氨基酸的YMDDYIDDZYVDD,即在HBVYMDD基因序区发生碱基替化 D743或A741G,即 Atg, Att/Gtg。Locarni等9报道认为M552V是拉米夫定耐药突变的主要形 式，而有些突变中出了这些碱基突变总伴随着 P基因B区的L528M突变，两种 突变同时存在可能与 M552V和M5521耐药性强弱有关10。HBV感染的