以磷酸二酯酶为主要靶点的阿魏酸抗阿尔兹海默病作用机制研究

1、以磷酸二酯酶为主要靶点的阿魏酸抗阿尔兹海默病作用机制研 究越来越多证据表明，磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE )在学习和记忆过 程中发挥了很大作用,其相应的抑制剂能通过调控细胞内环磷酸腺甘(cyclic adenosine monophosphate,c AMP )含量来改善中枢神经系统退行性疾病所致的 学习记忆障碍。因此寻找特异性PDEffl制剂是目前国内外各大药理实验室的研究 热点。我们近期的实验结果显示，阿魏酸(ferulic acid,FA )能调节PDE的表达及 活性，从而影响生物体的各种代谢。但是FA是如何对PDB!行调控以及面对PDE 这样一个庞大的超家族,

2、FA是针对其中某一种亚型发挥特异性调节作用还是发 挥非特异性PDE调节作用并不明确。本项目通过现代分子生物学手段明确 FA对PDE1型表达有抑制作用，并对其 下游信号通路具有调节作用，并在整体动物学实验上验证FA抗阿尔茨海默病(Alzheimer ' s disease,AD )样炎症作用与其对PDE的表达抑制作用密切相关。 这些工作将不仅为AD的特异性靶向治疗提供安全有效的天然药物，同时也为FA 的药理作用及机制深入研究提供理论支撑。本课题展开了相关的研究工作，包括以下四个部分。第一，运用分子对接的方 法模拟FA与PD4B2勺相互作用。分子对接结果表明,FA可与包括Tyr233、Hi

3、s234、Met347、Asn395 Phe414 Gln443、和Phe446在内的氨基酸残基发生强烈的相互作用，数据还表明，FA可进 入PDE4B2勺结合腔,并与氨基酸残基 Phe446和Phe414形成兀sup：t /sup相 互作用。在FA与氨基酸残基Gln443和His234之间可发现有氢键。FA的构象位于疏水腔区域,表明FA与PDE4B2间存在静电和疏水性相互作用。分子对接结果从理论上支持了 FA对PDE4鼬活性及表达的潜在影响，表明 FA可被用作基本结构来设计 PDE4W制剂，应进行进一步的研究来证实该相互作 用。第二,体外研究FA对A B <sub>25-35<

4、;/sub>和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS )所致PC12细胞损伤的保护作用。检测了超氧化物 歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性，炎性因子(TNF-a 和 IL-1 0 )的表 达;检测与抗AD作用密切相关c AMP和Ca²⁺&度；另外，检测FA对 神经生长因子(nerve growth factor,NGF )对PC12细胞分化的促进作用。实验结果表明FA能显著降低A0 _25-35和LPS所致TNF-a和 IL-1 B水平的升高，同时升

5、高SOD勺表达水平,从而验证了其强大的抗炎和抗氧 化功能。FA能够抑制LPS所引起的c AM冰平的降低；通过激光共聚焦技术检测 细胞内Ca<sup>2+</sup澈度的变化，发现FA能够有效降低LPS所弓I起的PC12 细胞内Ca<sup>2+</sup澈度的升高;FA与NGFW?育，增强NGFW导PC12细胞 的分化作用。初步推测FA有可能对PDEg达具潜在抑制作用。第三,PDE4B可调节细胞内 c AMPzK平和 c AMP/c AMFS答元件结合蛋白(c AMPresponse element binding protein,CREB )通路。进一步研

6、究FA对LPS诱导PC12细胞磷酸二酯酶4B (PDE4B上调表达及活 性的影响，使用激光共聚焦显微镜检测FA对LPS诱导PC12ffi胞骨架蛋白F-actin 变化的影响。我们进一步检测 FA对LPS诱导的c AMP特异性PDE活性和细胞炎 性因子(TNF-a和IL-1 B )及ROS生的影响；通过实时荧光定量 RT-PCR(real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Q-PCR )检测 LPS诱导 PC12a月fi PDE4Bm RNAft达；通过免疫印 迹对PDE4B

7、 CREEft磷酸化CREB(p CREB的蛋白表达进行检测。FA对LPS所致PC12Mlfi F肌动蛋白(F-actin )骨架的损伤具有保护作用， 明显改善细胞骨架蛋白F-actin的分布和结构。显著抑制LPS诱导的TNF-a、 IL-1 B 及活性氧(reactive oxygen species,ROS )的产生。酶活性试验表明，FA可明显减弱LPS诱导PC12ffi月fi c AMP依赖性PDEW活 性的上调。对PC12细胞PDE4B m RN的研究表明，FA预处理可减少由LPS诱导 的PDE4B m RNA!达上调。免疫印迹表明，FA预处理后，抑制LPS诱导的PDE4B1调彳用；对

8、抗LPS诱导 的CRE斯p CREB下调作用。FA对LPS诱导的PDE4限达上调的抑制作用及其 对下游信号分子CRE序口 p CRE法达下调的对抗作用可能是其对神经炎症性疾病 比如AD样神经炎症具有治疗作用的一个机制。第四，检测FA对LPS诱导Sprague-Dawley (SD大鼠学习和记忆缺失的保 护作用；探讨FA对LPS诱导海马神经细胞损伤的保护作用及机制 ？在本研究 中,Morris水迷宫试验检测FA对抗LPS诱导的大鼠学习和记忆缺失作用，苏木精 -伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE )检测FA对LPS损伤大鼠大脑皮 层和海马神经元的组织病理学保护作用

9、 ？免疫荧光法检测FAXt LP%伤海马神经 元细胞骨架蛋白B-tubulin 的保护作用？为阐明FA对LPS诱导的海马神经元的 保护作用，检测SOD舌性;Q-PCR检测FA抗LPS诱导的IL-1 B ?caspase-1?Nod样 受体蛋白 3 (Nod like receptor protein,NLRP3 )和 PDE4B勺 m RNAg达彳乍用； 免疫印迹法检测PDE4B NLRP3f口 CRE强p CREEg白的表达？免疫组织化学染色 法检测FA对LPS诱导大鼠海马神经元CA1?CA»口 CA3区PDE4E®白表达的影响？Morris水迷宫试验表明FA预处理对抗L

10、PS诱导的大鼠学习记忆功能障碍;HE 染色显示，预先给予不同剂量FA可以减轻腹腔注射LPS诱导的SD大鼠海马神经 元损伤；与LPS组相比,FA预处理组大鼠海马神经元B -tubulin 蛋白表达增加;FA 预处理显著维持大鼠大脑皮层和海马神经元中被LPS抑制的SOD勺活性;FA预处理显著抑制LPS诱导的IL-1 B ?capase-1?NLRP邵口 PDE4国勺m RNAK平的增 加？Western蛋白印迹分析表明，相较于LPS组,FA预处理组的CREEK p-CREB的 表达增加，同时抑制LPS诱导的大鼠海马神经元中PDE4前NLRP3勺表达；免疫组 化染色结果显示，FA预处理显著抑制了 LPS诱导