培养基配制201603-2

1、实验一：培养基母液配置（8、9）1. 清洗器皿（初次使用注意事项）并晾干。2. 配置N6培养基等母液（每种母液体积100ml）3. 培养皿（每组10个）清洗、晾干、报纸包裹、线绳捆扎、灭菌烘干4. 蒸馏水灭菌天平的用法：水平调节；称重时需要关好天平所有玻璃窗。药品内部的塑料盖，记得盖上，如果不明，擦拭干净再盖上。定容：先称2/3体积水，然后顺序加试剂，前一试剂溶解后，加另一试剂，最后用滴定瓶定容。值日：清洁桌面、地面；所有物品使用后归位（天平盖上罩子）；座椅归位；不迟到早退，需要的克数=（0.166g/147g）*165g摩尔浓度=0.166/147=x/1651） N6培养基母液（实际使用为

2、20x）：本次实验做100ml 10xKNO32.830gCaCl2·2H2O0.166g MgSO4·7H2O0.135gKH2PO40.400g(NH4)2SO40.463g注：配制时按表中所列顺序逐一添加，每种成分溶解后再溶解另外一种成分。2） B5微量母液：本次实验做： 1000ml (100倍)含KI0.0750gH3BO30.3000gMnSO4·H2O1.0000gZnSO4·7H2O0. 2000gNa2MoO4·2H2O0.0250gCuSO4·5H2O0.0025gCoCl2·6H2O0.0025g注：本

3、次实验各试剂用量过少，精确度不够，可全班3个组先做1000X，再平均分成3份给每个组。天平用万分之一天平。3） B5有机母液：烟酸（Nicotinic acid）1mg/ml盐酸吡哆醇(VB6)1mg/ml盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇(myo-Inositol)10 mg/ml4)铁盐：本次实验做：100ml (100倍)FeSO4·7H2O0.278gNa2EDTA·2H2O0.373g注：配制顺序如下1. 称取0.278g FeSO4·7H2O溶解于20ml去离子水中（A）。2. 称取0.373g Na2-EDTA·2H2O溶解于20 m

4、l去离子水中（B）。3. 将B置于70水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。4. 将A倒入C中混合，置于70水浴锅中保温2h（小时）。5. 定容至100ml。5）激素激素溶解方法母液浓度6-BA加稀碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容1 mg/mlNAA加碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容1 mg/ml2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容0.25 mg/ml实验二：培养基配置及灭菌（10）1 灭菌，晾凉：培养皿、枪头、蒸馏水（开、关盖子）后，培养皿烘干。2 （2-3小时）培养基配制：母液称量、添加琼脂、调节pH、导入三角瓶，放入磁力搅拌棒，灭菌，凉到50-60度左右，摇匀，分别注入培养

5、皿（25ml左右）3 超净台风干后，保鲜膜包装，放入4度冰箱，可挑选一培养皿（包好）放于25度，进行污染观察。培养基配方1) 每组做三个0.1升，分别放到三角瓶里，封口，每0.1升含有：N6大量元素（10x）：10mlB5微量：1ml铁盐：1ml烟 酸：0.1 ml盐酸吡哆醇：0.1 ml盐酸硫胺素：0.1 ml肌 醇：1mlL-pro: 0.28g蔗糖：3gCH （Casein acid hydrolysate）:0.03g2,4-D :0.8mlPhytagel:0.4gPH值：58粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：N6大量元素（10x）：100mlB5微量：10ml铁盐：10ml

6、烟 酸：1 ml盐酸吡哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-pro:2.8g蔗糖：30gCH :0.3g2,4-D :8mlPhytagel:4.0gPH值：582）培养基配置（1）在配置培养基时取适量(配置培养基总量的2/3左右)的蒸馏水放入容器内。（2）把锅放在电磁炉上加热，同时加入剪断的琼脂条。 （3）不停搅拌，防治粘锅，同时加速溶解。 （4）按量称取蔗糖并加入，同时搅拌。（5）待琼脂条、蔗糖完全溶解后加入母液、母液（80左右），然后搅拌均匀。 （6）加入铁盐。（7）待培养基冷却至50-60时加入有机成分，到培养基达到40时加入激素。（8）加入蒸馏水定容到量，测定pH值，

7、用0.1mol/L NaOH 或HCL 将培养基的pH调至所需数值（PH=6.0左右）。 （9）清洗培养瓶、培养盖，沥干水份。 （10）用分装器将培养基分装到三角瓶中，趁热分装。分装时注意不要将培养基溅到容器壁口，以免引起污染。分装量根据培养材料不同而异，每瓶装入100ml。 11）选用合适的封口材料包扎好瓶口或盖上瓶盖。 12）在培养基瓶上贴上标签或用记号笔在瓶壁上注明培养基的代号、配制时间等，以免混淆。然后用塑料周转筐运至灭菌室准备灭菌。 13）同时对实验时所需要的解剖刀、解剖针、纱布、镊子、无菌水灯放入高压灭菌锅内灭菌。注意事项：（一）准备的药品2，4-D加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容0

8、.25 mg/ml1N NaOH（4g溶于100ml水中）、1N HCl（8.3ml溶于91.7ml水中）70%酒精（70ml酒精溶于30ml水）（二）移液器的使用 （三）高压灭菌操作步骤 1）首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 2）放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3）加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 4）加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气

9、。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间（121摄氏度/15分钟）。 5）灭菌所需时间到后,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染注意：1、锅内加的水一定要为去离子水，以避免锅底水垢产生。2、锅内的水一定要没过底部平板，以防甘烧。3、每次灭菌之前都要检查灭菌的时间温度设置。4灭菌完毕压力未降至0时，千万不要随意打开顶

10、盖。（三）超净工作台1.实验前将紫外灯开启20min以上。2.用棉球蘸取70%酒精将超净工作台整个空间擦拭一遍。3.进行无菌操作时，动作尽量轻柔，时刻保持无菌意识。（四）无菌室无菌室应定期（每星期）用酒精或84消毒液消毒，配合紫外线灭菌灯每次开启20分钟以上，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。实验三：种子消毒接种（11）准备物品：酒精灯，1 提前灭菌：50ml离心管、蒸馏水、镊子、滤纸(锡箔纸包裹)等2 （2小时）种子消毒：70%酒精，次氯酸钠，灭菌水清洗、种子放于滤纸上晾干。3 （0.5小时）接种：用镊子（每次火焰灼烧）水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1 消毒：

11、取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1） 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿1214颗；2） 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30光照培养箱，培养4周；3） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈

12、伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30光照培养箱，继代培养1-2周。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)溶液配制30%次氯酸钠溶液：V NaClO：VH2O=1：270%酒精：稀释100%或95%的乙醇至70%实验四：种子N6培养基培养（12）挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（30-60天）。苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗。注：分化过程中不可将愈伤继代培养。以上操作步骤皆在无菌条件下进行。实验五：愈伤组织继代培养（13）粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基（每升含量）：N6大量元素：50mlB5微量：

13、10ml铁 盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸吡哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu L-Glutamine：0.5 gL-pro:2.8gCH :0.3g2,4-D8ml蔗 糖30gPhytagel:4.0gPH值：58实验六：诱导长芽（14）粳稻分化培养基配方（每升含量）：N6大量元素：50mlB5微量：10ml铁 盐：10ml烟 酸：1 ml盐酸吡哆醇：1 ml盐酸硫胺素：1 ml肌 醇：10mlL-Glu：0.5 gL-pro:0.5 gCH :0.3g6-BA:3 mlNAA0.5 ml蔗 糖：30gAgar 8 gPH值： 58实验七：诱导生根（15）6） 粳

14、稻生根培养基配方（每升含量）：N6大量元素：25mlB5微量：5ml铁盐：5ml烟 酸：0.5ml盐酸吡哆醇：0.5 ml盐酸硫胺素：0.5 ml肌 醇：5ml蔗 糖：20gagar: 8.0gpH5.8实验八：移栽驯化（16）锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。水稻苗期水培营养液配方：Macro-nutrient solution (mM)元素终浓度使用盐类分子量(g/mol)母液(103)用量(

15、g/L)N2.5(1.25 mM)NH4NO380.04100P0.3KH2PO4136.0940.83K1(0.35mM)K2SO417460.9Ca1CaCl2·2H2O147147Mg1MgSO4·7H2O246.5246.5SiO20.5Na2SiO3·9H2O284.2142.1Micro-nutrient solution (µM) Mn9MnCl2·4H2O197.921.781Mo0.39Na2MoO4·2H2O241.950.0944B20H3BO361.831.2366Zn0.77ZnSO4·7H2O287.560.2214Cu0.32CuSO4·5H2O249.680.0799Fe20FeSO4·7H2O+Na2_EDTA278.025.57注: 2 制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL母液。3 制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时