医学硕士研究开题报告范文3

1、company logo神经元形成、干细胞增殖、星神经元形成、干细胞增殖、星形胶质细胞和细胞凋亡的在各形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测发育阶段人胚胎脊髓中的检测导师导师 xx xx 教授教授 研究生研究生 xxxxcompany logon一、课题名称一、课题名称:神经元形成、干细胞增殖、神经元形成、干细胞增殖、星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测胚胎脊髓中的检测n二、研究目的及意义二、研究目的及意义n三、立论依据和国内外研究现状三、立论依据和国内外研究现状n四、实验方法四、实验方法 1、动物和试剂、动物和试剂 2、仪

2、器、仪器 3、实验详细步骤、实验详细步骤company logon五、预期目标五、预期目标n六、已具备条件和个人条件六、已具备条件和个人条件n七、前期工作基础（可行性）七、前期工作基础（可行性）n八、研究工作的主要阶段、进度和完成时八、研究工作的主要阶段、进度和完成时 间间 n九、经费预算九、经费预算n十、实验风险及前景分析十、实验风险及前景分析company logo一一 课题名称：课题名称： neun，nestin，gfap在人胚胎脊髓发育过在人胚胎脊髓发育过程中的表达及凋亡细胞的检测程中的表达及凋亡细胞的检测二二 研究目的及意义：研究目的及意义： 目的：目的：1.检测检测nestin，

3、gfap，neun在人胚在人胚胎脊髓各个发育阶段中的表达及变化；胎脊髓各个发育阶段中的表达及变化； 2.不同发育阶段的人胚胎脊髓中凋亡细胞的不同发育阶段的人胚胎脊髓中凋亡细胞的检测。检测。company logo意义：检测在人胚胎脊髓中神经干细胞、神意义：检测在人胚胎脊髓中神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、凋亡细胞的时空变化经元、星形胶质细胞、凋亡细胞的时空变化规律，探讨其在人胚胎脊髓发育过程中的机规律，探讨其在人胚胎脊髓发育过程中的机制，脊髓发育缺陷的机制，以期为人类胚胎制，脊髓发育缺陷的机制，以期为人类胚胎脊髓的发育规律，脊髓损伤后的治疗、修复脊髓的发育规律，脊髓损伤后的治疗、修复提供理论

4、依据。提供理论依据。 company logo三三 立论依据和国内外研究现状立论依据和国内外研究现状1. 脊髓损伤严重威胁人们的健康和生活质脊髓损伤严重威胁人们的健康和生活质量，被视为临床治疗的难题。脊髓损伤量，被视为临床治疗的难题。脊髓损伤后的修复一直是神经科学研究领域的一后的修复一直是神经科学研究领域的一大难题。近年来神经干细胞的发现及其大难题。近年来神经干细胞的发现及其相关研究为脊髓损伤的治疗提供了一种相关研究为脊髓损伤的治疗提供了一种新的策略。新的策略。company logo 神经干细胞的生物学特性为神经干细胞的生物学特性为1(gage f h ,2000)：能分化为神经组织或来源于

5、神能分化为神经组织或来源于神经系统；经系统；具有自我更新能力；具有自我更新能力；通过非对通过非对称分裂产生新的细胞。称分裂产生新的细胞。 神经干细胞存在于神经干细胞存在于中枢神经系统的各个发育阶段。在胚胎神经中枢神经系统的各个发育阶段。在胚胎神经发育过程中，神经干细胞的繁殖发生于神经发育过程中，神经干细胞的繁殖发生于神经管相连的中央管表面管相连的中央管表面2(马以骝 , 2001 )。company logo 神经干细胞由胚胎早期的室管膜上皮产生且神经干细胞由胚胎早期的室管膜上皮产生且具有多向分化潜能，可通过对称或不对称分具有多向分化潜能，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化成逐渐变小的子

6、细胞，裂出新的干细胞或分化成逐渐变小的子细胞，最终产生神经元细胞、星形胶质细胞和少突最终产生神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞胶质细胞3(cataudella t, 2004 )。company logo 神经巢蛋白（神经巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein, nestin）是）是hockfield和和mckay于于1985年首先发现的第年首先发现的第类中间丝蛋白质，类中间丝蛋白质，主要在胚胎期神经前体细胞和神经干细胞主要在胚胎期神经前体细胞和神经干细胞呈一过性表达。主要定位于细胞质，是未呈一过性表达。主要定位于细胞质，是未分化状态多能神经干细胞的标志

7、性抗原。分化状态多能神经干细胞的标志性抗原。company logo nestin表达起始于神经板的形成，随着神经表达起始于神经板的形成，随着神经干细胞的不断分化，最终成为成熟的神经元干细胞的不断分化，最终成为成熟的神经元和胶质细胞时，巢蛋白分别被神经丝和胶质细胞时，巢蛋白分别被神经丝（neurofilament,nf）蛋白和胶质纤维酸）蛋白和胶质纤维酸性蛋白（性蛋白（gfap）等所取代）等所取代4(hockfield s ,1985)。 许多动物实验表明在中枢神经系许多动物实验表明在中枢神经系统的不同发育阶段，神经干细胞与神经元和统的不同发育阶段，神经干细胞与神经元和神经胶质细胞是同时并存的

8、，其比例随着胚神经胶质细胞是同时并存的，其比例随着胚龄的增长而发生变龄的增长而发生变5(conrad a m ,2002)。 company logo2. 胶质细胞是神经系统中除神经元外的另一胶质细胞是神经系统中除神经元外的另一类细胞成分。数量上胶质细胞远多于神经类细胞成分。数量上胶质细胞远多于神经元，有报道元，有报道cns内胶质细胞与神经元的数内胶质细胞与神经元的数目之比为目之比为10：150：1。星形胶质细胞。星形胶质细胞约占正常成人中枢神经系统细胞总数的约占正常成人中枢神经系统细胞总数的40。星形胶质细胞在中枢的作用不仅仅是。星形胶质细胞在中枢的作用不仅仅是保护、营养和支持，还参与血脑屏

9、障的保护、营养和支持，还参与血脑屏障的company logo 构成、水的转运、递质的代谢和释放、离构成、水的转运、递质的代谢和释放、离子平衡的维持等子平衡的维持等68(van dc graaff ,1998; sulyokl e ,2004;朱长庚.神经解剖学 )。胶质纤维。胶质纤维酸性蛋白（酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）是构成神经胶质细胞的主要细胞骨）是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞的架蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状态功能状态9(bigini p ,2001)。company logo 活化

10、的星形胶质细胞内活化的星形胶质细胞内gfap的增高，可能的增高，可能起保护神经元的作用，星形胶质细胞在损起保护神经元的作用，星形胶质细胞在损伤区分泌多种神经营养因子，以促进中枢伤区分泌多种神经营养因子，以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活神经和周围神经轴索的生长和存活10(jc de la torre ,2002)。company logo 3. 在神经系统发育中一个引人注目的现象在神经系统发育中一个引人注目的现象就是伴随着细胞生长分化的同时也发生大就是伴随着细胞生长分化的同时也发生大量的细胞死亡。发育中出现的这种由细胞量的细胞死亡。发育中出现的这种由细胞内特定基因程序性表达介导的细胞死亡

11、称内特定基因程序性表达介导的细胞死亡称为程序性细胞死亡（为程序性细胞死亡（programmed cell death，pcd）。有人估计胚胎时期产生）。有人估计胚胎时期产生的神经元在向成体发育过程中通过的神经元在向成体发育过程中通过pcd几几乎丢失了乎丢失了5080。 company logo 很多研究表明很多研究表明pcd存在于神经系统发育存在于神经系统发育的多个环节的多个环节11(naruse i ,1995)，从未分，从未分化的神经上皮到迁移后的有丝分裂后细化的神经上皮到迁移后的有丝分裂后细胞，从神经管的形成胞，从神经管的形成12(李泽桂,1999)到神到神经元与靶区的匹配都有经元与靶区

12、的匹配都有pcd发生，凡不发生，凡不能与靶区正确匹配和参与正常神经网络能与靶区正确匹配和参与正常神经网络形成的神经元均通过形成的神经元均通过pcd加以清除加以清除13 (homma s ,1994)。 company logo四四 实验方法实验方法4.1 动物和试剂动物和试剂n收集从收集从3周到周到8个月共个月共15个时段的人胚胎脊髓个时段的人胚胎脊髓标本标本81例；例；n所需试剂：所需试剂：封闭用正常羊血清（原液）封闭用正常羊血清（原液） 厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司 批号：批号：zli-company logo 配制方法：封闭用正常血清原液可用配制方

13、法：封闭用正常血清原液可用pbs或或tbs稀释成稀释成5-10%（即（即1：10-1：20倍稀倍稀释）后使用。释）后使用。3h2o2 厂家：天津市化学试剂三厂厂家：天津市化学试剂三厂 批号：批号：050905 配制方法：配制方法：30% h2o2 50ml + 蒸馏水蒸馏水company logonestin、neun、gfap抗体抗体 nestin：chemicon公司（批号mab5326) neun：chemicon公司（批号公司（批号mab377） gfap：upstate公司（批号公司（批号07650） 20 冰箱保存，稀释后4 保存pv9000免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒 厂家：中杉

14、公司厂家：中杉公司 lot : 50910 2-8保存company logodab显色液（显色液（zli-9032） 批号：批号：1386184 2-8保存保存pbs缓冲液缓冲液柠檬酸盐修复液柠檬酸盐修复液tunelpod试剂盒试剂盒 厂家：厂家：roch公司公司 批号：批号：company logo4.2 仪器或设备：仪器或设备：(1) 高压锅高压锅:厂家：潮安县顺发五金制品有限公司厂家：潮安县顺发五金制品有限公司 批号：批号：xk16-203-00048(2) 显微镜显微镜:厂家：厂家：olympus 批号：批号：xs-212-company logo(3) lx-100手掌型离心机手掌

15、型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂(4) ht-200微量电子天平微量电子天平厂家：成都善瑞逊电子有限公司厂家：成都善瑞逊电子有限公司(5) lx-100手掌型离心机手掌型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂company logo4.3 附助器皿、试剂及常规设备：附助器皿、试剂及常规设备： 手术器械，手术器械，10中性甲醛，系列脱水缸中性甲醛，系列脱水缸及脱蜡缸，包埋盒，切片架，耐高温切及脱蜡缸，包埋盒，切片架，耐高温切片架，湿盒，片架，湿盒，4冰箱，冰箱，20冰箱，冰箱，37恒温箱，恒温箱，60烤箱，洗瓶，烤箱，洗瓶，pap划划圈笔。

16、圈笔。company logo3. 实验详细步骤实验详细步骤（1）取材）取材 （2）固定）固定（3）制作石蜡切片）制作石蜡切片放入包埋盒中已固定好的组织用自来水放入包埋盒中已固定好的组织用自来水冲洗冲洗24小时（为了把甲醛除去）；小时（为了把甲醛除去）； 脱水；脱水； 透明；透明； 浸蜡；浸蜡； 切片：切成切片：切成5m厚的切片；厚的切片； 贴片：载玻片经过防脱片处理贴片：载玻片经过防脱片处理 。company logounestin、neun、gfap免疫组化步骤：免疫组化步骤：1. 石蜡切片进行常规脱蜡、水化：石蜡切片进行常规脱蜡、水化： 二甲苯二甲苯10min 二甲苯二甲苯10min 无

17、水乙醇无水乙醇10 min 95乙醇乙醇5min 90乙醇乙醇5min 80乙醇乙醇5min 70乙醇乙醇5min 蒸馏水蒸馏水3-5min 蒸蒸馏水馏水3-5min。company logo2. 抗原修复：抗原修复：（1）高温高压抗原修复：）高温高压抗原修复： 取适量的柠檬酸盐缓冲液取适量的柠檬酸盐缓冲液（ ph6.0 ）于压力锅中（缓冲液的量必须能足够浸于压力锅中（缓冲液的量必须能足够浸没整个切片）放置于电磁炉上加热至沸没整个切片）放置于电磁炉上加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的缓冲液中。温染色架上，放入已沸腾的缓冲液中。c

18、ompany logo 盖上锅盖扣上压力阀，继续加热至喷汽，盖上锅盖扣上压力阀，继续加热至喷汽，扣阀至喷汽以扣阀至喷汽以4-6min为佳。时间到，压为佳。时间到，压力锅离开热源。稍置数分钟后，用自来力锅离开热源。稍置数分钟后，用自来水冲淋使之冷却，去阀开盖，室温放置水冲淋使之冷却，去阀开盖，室温放置20min。自然冷却后取出切片。自然冷却后取出切片。（2）微波抗原修复）微波抗原修复 取适量柠檬酸盐缓冲液（取适量柠檬酸盐缓冲液（ph6.0）于烧）于烧杯中放入微波炉里加热至沸腾，将脱蜡杯中放入微波炉里加热至沸腾，将脱蜡 company logo 后置于耐高温切片架上的切片放入沸腾的后置于耐高温切片

19、架上的切片放入沸腾的柠檬酸缓冲液中继续加热柠檬酸缓冲液中继续加热10min即可，即可，取出烧杯，室温中通风处放置取出烧杯，室温中通风处放置2030min。自然冷却后取出切片。自然冷却后取出切片。3.用用0.01m pbs冲洗冲洗2-3min3%h2o2去离子水浸泡去离子水浸泡10min（以阻断内源性过（以阻断内源性过氧化物酶活性）氧化物酶活性）pbs冲洗冲洗3次，每次次，每次5min。company logo4.5羊血清室温下封闭羊血清室温下封闭30分钟。分钟。5.甩去羊血清，不洗，直接在切片组织上滴甩去羊血清，不洗，直接在切片组织上滴加适量稀释的抗体（加适量稀释的抗体（nestin、neun

20、、gfap一抗），置于一抗），置于4冰箱过夜。切片置冰箱过夜。切片置于湿盒中。于湿盒中。6.次日上午把切片从冰箱中取出，先在室温次日上午把切片从冰箱中取出，先在室温中放置中放置30min（以使切片适应室温以使切片适应室温）。company logo 7. 0.01m pbs冲洗冲洗3次，每次次，每次5min。除。除去去pbs（用力甩去）。每张切片上加一（用力甩去）。每张切片上加一滴试剂滴试剂 1（中杉公司的免疫组化试（中杉公司的免疫组化试剂盒剂盒pv-9000），室温下孵育），室温下孵育20min。 8. 0.01m pbs冲洗冲洗3次，每次次，每次5min。除。除去去pbs。切片上滴加试剂。

21、切片上滴加试剂2（pv-9000），室温下孵育室温下孵育30min。company logo9. 0.01m pbs冲洗冲洗3次，每次次，每次5min。除去。除去pbs。切片上滴加新配制的。切片上滴加新配制的dab显色液，显色液，不时在显微镜下观察显色情况。切片浸入不时在显微镜下观察显色情况。切片浸入蒸馏水中以中止显色。蒸馏水中以中止显色。10. 切片中止显色后，流水冲洗切片中止显色后，流水冲洗10min。11. 脱水、透明。脱水、透明。 12. 中性树胶封固中性树胶封固 。company logo细胞凋亡原位检测的步骤：细胞凋亡原位检测的步骤：采用采用tunel细胞凋亡检测试剂盒细胞凋亡检测

22、试剂盒1.石蜡切片常规脱蜡至水。石蜡切片常规脱蜡至水。2.新鲜配制新鲜配制3%h2o2，室温处理，室温处理15min。0.01m pbs液洗涤液洗涤5min3次。次。company logo 3.切片上滴加消化液（切片上滴加消化液（10mm tris-hcl 995ul加入加入1mg/ml proteinase k 新鲜新鲜稀释至稀释至 5ug/ml）,37消化消化20min，0.01m pbs洗洗5min3次。次。 4.新鲜配制通透液，新鲜配制通透液，4孵育孵育20min或室温或室温孵育孵育8min。0.01m pbs洗洗5min3次。次。company logo 通透液：取通透液：取20

23、x ssc 20ul，tritionx-100 4ul（45-50预热），预热）， 加单蒸水加单蒸水3.98ml，定容至，定容至100ml，充分均匀。，充分均匀。5.标记标记 甩去切片上多余液体，标本片擦干甩去切片上多余液体，标本片擦干组织及周边水分，按每张切片滴加组织及周边水分，按每张切片滴加1液和液和 2液（液（1：9，混合均匀）配成，混合均匀）配成tunel反应反应混和液（冰上操作）。混和液（冰上操作）。company logo 阴性对照组只加入试剂阴性对照组只加入试剂2液，而不加液，而不加1液。液。标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，37标记标记1h

24、，后，后4过夜。（过夜。（20h以上）。以上）。0.01m pbs洗洗5min3次。次。6.滴加滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温中牛血清白蛋白封闭液，室温中30min，甩掉封闭液，不洗。，甩掉封闭液，不洗。 company logo7.转化剂转化剂pod 50l/片滴加至标本片上。片滴加至标本片上。置样品于湿盒中，置样品于湿盒中，37孵育孵育40min. 0.01m pbs洗洗5min3次。次。8.dab显色，室温显色，室温5-10min。单蒸水中止显。单蒸水中止显色，流水冲洗色，流水冲洗10min。9. 脱水，透明，封片。脱水，透明，封片。company logo五五 预期目标预期目标1.检

25、测不同发育时期的人胚胎脊髓中检测不同发育时期的人胚胎脊髓中nestin、neun、gfap的表达及变化；的表达及变化；2.检测不同发育时期的人胚胎脊髓中细胞凋检测不同发育时期的人胚胎脊髓中细胞凋亡的情况；亡的情况；3.探讨脊髓内神经元、神经干细胞、星形胶探讨脊髓内神经元、神经干细胞、星形胶质细胞与细胞凋亡高峰出现的时间点有何质细胞与细胞凋亡高峰出现的时间点有何相关性。相关性。company logo六六 已具备的条件已具备的条件1. 本研究所下属三个实验室：组织化学实验本研究所下属三个实验室：组织化学实验室、细胞室和分子生物学实验室，可开展室、细胞室和分子生物学实验室，可开展从形态至分子生物学

26、技术的相关研究。从形态至分子生物学技术的相关研究。2. 导师李力燕教授和王廷华教授多年来从事导师李力燕教授和王廷华教授多年来从事神经科学的研究，尤其在脊髓发育的研究神经科学的研究，尤其在脊髓发育的研究方面积累了丰富的经验，可提供宝贵的理方面积累了丰富的经验，可提供宝贵的理论和实践指导。论和实践指导。company logo七七 前期工作基础（可行性）前期工作基础（可行性）1. 本研究所具有专门的分子室、细胞室、免本研究所具有专门的分子室、细胞室、免疫组化室，且各项技术都很成熟；疫组化室，且各项技术都很成熟；2. 已完成了神经营养因子家族与受体（包括已完成了神经营养因子家族与受体（包括ngf、b

27、dnf、nt-3、nt-4、trka、trkb、trkc）在人胚胎脊髓中的免疫组化）在人胚胎脊髓中的免疫组化染色；染色；3. 掌握了免疫组织化学、原位杂交、掌握了免疫组织化学、原位杂交、h-e染染色的实验技术。色的实验技术。company logo八八 研究工作的主要阶段、进度和完成时间研究工作的主要阶段、进度和完成时间1. 实验所需标本已制作完成实验所需标本已制作完成2. 2007.112008.1开始做预实验及正开始做预实验及正式实验式实验3. 2008.12008. 4 观察结果，图像分观察结果，图像分析统计，撰写论文析统计，撰写论文company logo九九 经费预算经费预算1. n

28、estin、neun、gfap三个抗体价格三个抗体价格anti-neun：3437.50元（元（chemicon公公司）司）anti-nestin：3000元（元（chemicon公司）公司）anti-gfap：3737.50元（元（upstate公司）公司）company logo2. 免疫组化试剂盒免疫组化试剂盒 第二代通用型二步法检测系统（北京中杉第二代通用型二步法检测系统（北京中杉公司，公司，pv-9000） 320.00元元/3.0ml3. 细胞凋亡原位检测试剂盒（细胞凋亡原位检测试剂盒（tunel） roche公司公司 4600元元4. 封闭用正常羊血清（原液）（北京中杉公封闭用正

29、常羊血清（原液）（北京中杉公 司，司，zli9020）45元元/company logo 5. 其他常规试剂约其他常规试剂约200元。元。 十十 实验风险及前景分析实验风险及前景分析 1. 由于实验对象是人胚胎标本，无法及时由于实验对象是人胚胎标本，无法及时灌注固定，故有可能导致标本固定不及时灌注固定，故有可能导致标本固定不及时不充分，从而使组织结构不完整，损失一不充分，从而使组织结构不完整，损失一部分抗原等；部分抗原等；company logo2. 实验结果与预期不符实验结果与预期不符 这就要求我们从标本固定取材开始直至这就要求我们从标本固定取材开始直至后续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检后

30、续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检测都严格操作，不忽视每一个环节、每一测都严格操作，不忽视每一个环节、每一个步骤。试剂准备充分，实验设计合理，个步骤。试剂准备充分，实验设计合理，实验操作熟练、准确，努力将实验风险控实验操作熟练、准确，努力将实验风险控制到最小程度。制到最小程度。company logo参考文献1 gage f h. mammalian neural stem cells j. science, 2000, 287: 1433-1438.2 马以骝，杨志敏，王秦秦 等。大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究。立体定向和功能性神经外科杂志，2001，14（2）：6369.3 c

31、ataudella t, conti l, cattaneo e. neural stem and progenitor cells:choosing the right shc. prog brain res, 2004,146: 127-133.4 hockfield s,mckay rd. identification of major cell classes in the developing mammalian nervous system j. j neurosci. 1985. 5: 3310-company logo5 conrad a m, jean h, joan w b. analysis of the