生物学基础实验指导2015版

1、生物学基础实验指导农业工程专业用主编 吴薇中国农业大学工学院农业工程系目 录生物实验室守则(3)实验报告的撰写(4)实验一 显微镜的使用与徒手切片制片（2学时）. (5)实验二 细胞水平的生物进化（2学时）.(9)实验三 微生物的显微直接计数法（2学时）.(11) 实验四 真菌的组织块分离法（2学时）.(14)实验五 土壤中微生物的分离和识别（4学时） (16)实验六 生物培养基的制备和灭菌技术（4学时）.(18)实验七 总糖的测定（4学时）.(21)实验八 淀粉酶活性的测定（4学时）.(25)实验九 蛋白质的沉淀反应（2学时） .(28)实验十 蛋白质含量的测定（2学时）.(30)实验十一

2、分光光度法测定叶绿素含量（4学时）.(32)生物实验室守则为了使实验顺利进行，根据生物学实验的特点，提出以下要求：1. 进入实验室，应保持肃静，不可随便吃东西，禁止吸烟。2. 每次实验前认真预习实验指导及相关理论课讲授的内容，明确实验目的、原理和方法步骤及操作中的注意事项。3. 实验中严格遵守实验要求及操作规程，认真操作，培养从事科学研究工作的严谨态度。4. 按时观察实验结果，以科学的态度认真填写实验报告，力求简明准确、字迹清楚、绘图真实。5. 保持实验室的整洁，勿将用过的培养物、废纸、废液等随便乱扔，要放在指定地点。如有菌液污染桌面或地面时，应该用 75% 酒精覆盖0.5h 后才能擦去。6.

3、 实验用过的菌种以及带有活菌的各种器皿，应先经高压灭菌后才能洗涤。7. 在使用仪器、设备及玻璃器皿时，要认真小心，轻拿轻放，如有损坏，须做好登记，酌情予以赔偿。 8. 实验完毕，应将仪器用具等放回原处，擦净桌面，收拾整齐，然后用肥皂洗手，离开实验室前注意关好门、窗、灯、火、水、电等。实验报告的撰写1 主要准则实验报告是完全根据你自己的实验历程所撰写的，除小部分引用他人的文献之外，都必须是实实在在的实验结果与过程的记录。报告的长短与成绩不成正比，合理而有创见的一句话，比起千百行空话要有价值。2 实验报告的结构以下虽然大略描述一般报告的结构与写法，但报告的格式并无一定规格，只要写得合理、正确、一致

4、，均为好的报告。1） 实验目的简单描述实验的动机与目标。2） 实验原理通过课本学习、老师讲解与实验的过程，仔细理解本实验蕴涵的内在原理。3） 实验材料和用品写出本次实验所需要的实验仪器、药品、材料等物质条件。4） 实验步骤请写出你自己的实验步骤，完全记录下你所操作的流程与条件，而并非照抄讲义上的步骤。5） 注意事项在实验过程中有一些特别需要注意的地方，需要逐条列出。6） 实验结果条理清晰地写出你的结果，如实陈述观察所得到的现象。实验数据要经过整理后，做成图表以利判读；不要将原始资料原封抄录。若重复尝试过多次实验，请做整理，只写出有意义的结果，以免空占篇幅；但切勿遗漏重要结果。7） 实验分析与总

5、结由结果及所得到的观察现象，进一步整合分析，说明由结果所透露出来的信息。若有与事实或已知不符的现象，请仔细讨论或解释。实验一 显微镜的使用与徒手切片制片（2学时）一、实验目的和原理实验目的：1掌握一般光学显微镜的基本构造和功能，学习正确使用显微镜及其保护方法。2学习生物材料的徒手切片法实验原理：1显微镜有光学显微镜和非光学显微镜两大类。显微镜不仅应用于生物学领域，在医学、物理学、化学等领域的应用也很广泛，已经成为人们了解微观世界不可缺少的工具。光学显微镜能把微小的细胞或物体放大，其原理为透镜成像作用。光学显微镜分辨率由于受照射光线波长的限制，理论上其最小分辨距离为0.2m，实际能清晰看到的最小

6、物体直径约为0.5m大小，因此，在本实验中能看清细胞的一些主要结构。2徒手切片法是指用手拿刀片把新鲜材料切成薄片，徒手切片法所作的切片通常不经染色或经简易的染色后，封藏于水中即可观察，但也可制成永久制片。二、实验仪器 普通光学显微镜三、实验材料和用品（/组）1材料：植物幼茎或叶柄、植物叶片、胡萝卜等。2用品：载玻片、盖玻片、解剖刀、刀片、滴管、解剖针、镊子、吸水纸、美兰、香柏油、二甲苯、镜头纸。四、实验方法和步骤（一） 一般光学显微镜的构造：主要包括机械装置和光学系统两大部分。1 机械部分：是用来装置与调节光学部分的。（1） 镜座：用以稳定和支持显微镜。（2） 镜柱：镜座上的短柱，联系于镜座与

7、镜臂之间，用以支持显微镜 的其他部分。（3） 镜臂：多为弯柄状，拿显微镜时握此臂。它有支撑镜筒、载物台、照明装置以及调节焦距装置等作用。直筒显微镜的镜臂和镜座之间有一倾斜关节，可使显微镜在90度角范围内，随意倾斜成任何角度。（4） 镜筒：视线通过之圆筒。上端为目镜，下端为转换器。转换器上有24个物镜。（5） 调节器：一般安装在镜筒后方的两端，或安装在镜柱的侧面，有粗细两种调节器，调节焦距之用。粗调节器可使镜筒作较大幅度升降。细调节器用做比较精细的调节，能缓缓地控制镜筒升降。（6） 转换器：一般都安装在镜筒下方，是由两个金属圆盘叠合组成，上有24个孔，可依物镜放大倍数高低，顺序安装24个物镜。转

8、动转换器，可更换不同放大倍数的物镜。（7） 载物台：为放置标本的平台。位于镜筒的下方，中央有一孔，为光线通路。台上装有一对压片夹，用来固定标本。载物台上装有标本移动器，既可固定标本，又可前后左右移动标本。2 光学部分：包括产生物象的光学系统和照明光学系统两部分。（1） 目镜：装在镜筒上端，一般为10 放大倍数。（2） 物镜：物镜是显微镜的最重要部件，它决定显微镜的性能。一台显微镜常有24个物镜，分低倍镜（10）、高倍镜（40）和油镜（100）。显微镜的总放大倍数是目镜的放大倍数与物镜的放大倍数的乘积。（3） 聚光器和光圈：装置在载物台下面。聚光器是由一组聚光透镜组成。其主要作用是聚焦光线于观察

9、物上。光圈位于聚光器下方，由多个金属页片组合而成，有一小柄控制，推移小柄，可使光圈孔径缩小或放大，籍以调节入射光量，使照明调到最适程度。（4） 光源：在聚光器下面，本实验所用光源为专用显微镜照明灯光。底座的左侧面有灯光的亮度调节控制钮，可调节灯光亮度。（二） 一般光学显微镜的使用方法和保护：显微镜的使用应注意焦距和光度的调节。1 使用方法：使用显微镜时，应按下述步骤进行：（1） 主要姿势：将显微镜平稳地放置在自己前方的适当位置，镜臂向着自己，镜检者姿势要端正。用双眼观察，调节目镜眼距到适合的位置。（2） 打开电源：打开电源开关前，首先观察底座左侧面的灯光亮度调节控制钮，将其调至亮度最低处，然后

10、打开电源开关。（3） 调好光亮度：先把低倍物镜转至镜筒下方，使距载物台约1厘米处，然后将灯光的亮度调节控制钮调至适合位置，使能得到充分的照明。（4） 低倍物镜观察：将玻片标本放在载物台上，使待检查部分位于低倍镜正下方。然后，将物镜降至距标本约0.5厘米处，用目镜进行观察。调节灯光亮度和光圈的大小，使视野中的光亮适度（照明过强，微小物体反而不明显，容易被忽略过去），并用粗调节器慢慢向上旋转镜筒，直至影像出现，并找出最适于观察的部分，再用标本移动器推移到视野中央，改用细调节器调节，让物象十分清楚，以便仔细观察。如果你已将镜筒升到相当高，还未出现影像，那就可能是忽略过去了，应从侧面观察，再次把物镜放

11、至距标本约0.5厘米处，按上述方法重做，直至找到物象为止。注意：切忌在从目镜进行观察时，把镜筒向下转动，这样很容易使物镜碰压玻片而损坏。（5） 高倍物镜观察：使用高倍物镜时,一定先从低倍镜开始。当用低倍物镜找到目的物后,把要进行详细观察的部分移到视野正中,然后再将高倍物镜旋转到镜筒正下方。在旋转时,两眼须从显微镜的侧面注视。如若发现镜头有可能与玻片相撞，应检查其原因。这有两种可能性,一种可能是标本玻片放反了；另一种可能是原来低倍物镜中看到的并非是待检查的影像，而是玻片底面 (略升镜筒不再出现物象,即可判明是载玻片正面上物体的影像)。查究原因给予纠正后，重新按前述方法换高倍物镜，再从目镜观察。转

12、动细调节器，略升高镜筒,一般旋转半周至一周即可出现物象。调节细调节器,使物象达到最清晰为止。注意：在高倍物镜下调节焦距时,切勿使用粗调节器,以免压坏标本,损坏显微镜。 ( 6 ) 油镜观察:用高倍镜找到目的物，并推移到视野中央，用粗调节器提升镜筒(约2厘米),将油镜头转至镜筒正下方,在已找好的观察部位滴上一滴香柏油,用粗调节器将镜筒小心下降,同时目光应从显微镜的侧面观察,直至油镜头浸入油滴。注意一定不要将油镜头压到玻片上,以免损伤镜头和压坏标本。再从目镜观察,进一步调节光线,并用粗调节器使镜筒慢慢上升,当出现检查物的物象时,改用细调节器,使物象清晰。如油镜头已离开油面,还未见物象,可再按上述操

13、作重新进行。观察完毕后，旋开镜头, 先用擦镜纸将镜头上的镜油擦掉，再用沾有二甲苯的擦镜纸将镜头上残存的镜油擦掉，最后用没有二甲苯的擦镜纸将镜头抹拭干净。 2.显微镜的保护：显微镜是精密光学仪器，使用时一定要小心，注意保护。切忌水、酒精或其他化学药品等物浸损镜头、载物台或其他部分。显微镜的光学玻璃部分,切勿用手、手帕或其他纸张擦拭,只能用擦镜纸或绸布来轻擦。临时制片标本含水分较多,不能使用油镜观察。显微镜使用完毕，移去标本,将镜头移向两侧转成"八"字,再将镜筒下降,关闭光圈,用绸布擦净显微镜, 加上套罩,放入镜箱,送还原处。提放显微镜时,一定要右手握镜臂,左手托镜座,平贴胸部

14、,轻提轻放。 （三）徒手切片法：选择发育正常、有代表性的植物幼茎或叶柄，用解剖刀将材料切成23cm长，并把断面修平。一般以左手的大拇指、食指和中指等三个指头夹住材料，使材料突出于手指头上面约3mm，用右手平稳地握住刀片。切片时，使刀片与材料的断面保持平行，以均匀的动作横切面横切，材料与刀片须常以水湿润，切片切忌拉锯式切割，更不得中途打顿，切得薄而透明的薄片，然后平放在加有水滴的载玻片上，用解剖针展平后，加盖玻片观察。过于柔嫩的植物器官如叶片等，难以直接拿住来作切片，则需夹入坚固而易切的维持物中，便于执握操作。一般将要切的材料夹于已切成两半而中央挖成浅沟的夹持物内如萝卜或马铃薯块茎等，然后进行切

15、片操作。（四） 课堂练习 :临时制片观察：用镊子取切面完整、厚薄均匀的切片，放在载玻片上 ,在其上滴一滴蒸馏水，然后加盖玻片，置载物台上。按显微镜使用方法，在低倍镜和高倍镜下仔细观察。在做临时制片时，盖玻片下的水不宜过多，以恰能充满盖玻片与载玻片之间的空隙，使二者能贴着为宜。如果水过多，而使盖玻片贴得不稳时，可用小片吸水纸，从盖玻片的边沿将多余的水吸去。加盖玻片时,可先将它的一边与水滴接触，待水浸满整个边缘后,再把盖玻片轻轻放下，以免形成气泡，妨碍观察。这种制备显微镜观察用的临时玻片标本的方法，一定要熟练掌握。 五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做

16、完实验后，完成实验报告的全部内容。3. 你所观察到的植物叶片横切面结构从上表面到下表面的组织结构依次是什么？ 实验二 细胞水平的进化（2学时）一、实验目的和原理实验目的：1. 比较真核生物和原核生物结构的异同点，了解线粒体来源的内共生学说，了解真核生物和原核生物在进化上的关系，建立细胞进化的概念。 2. 了解植物细胞和动物细胞的异同点。3. 初步掌握常规的细胞活体染色技术。实验原理： 地球上现存的种类繁多的生物与细胞的各种细胞器是多少亿年漫长岁月的进化产物，真核细胞是由原核细胞进化而来，根据线粒体和叶绿体的内共生起源学说，线粒体起源于一种细菌类的原核细胞，而叶绿体起源于蓝藻类的原核细胞，它们最

17、早被原始的真核细胞吞入细胞内，与宿主进行长期的共生，而演化为重要的细胞器。本实验从染料对细胞及其结构的染色特点这一角度来验证线粒体的内共生学说。细胞内的许多结构在自然状态下近于无色，一般要经过染色后方可在普通光学显微镜下显示得比较清楚。不同的细胞组分对各种染料的亲和力不同，两者间亲和力强，染色就深，否则染色就浅或不染色，这样便能形成足够的反差以区分细胞的组分。一般生物染料不能穿透细胞膜，只有用化学试剂或物理方法固定细胞，破坏细胞膜结构后，染料才能进入细胞内部发挥其染色作用。有些染色剂对细胞无毒或毒性很小，并能进入活细胞内，显示活细胞的某些结构，称为活体染料，活体染料多为碱性染料，如中性红、詹纳

18、氏绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝等，它们能使细胞中某些特定结构着色，如中性红可以对细胞质中的液泡进行染色，詹纳氏绿可以对线粒体进行染色等。二、实验仪器光学显微镜、灭菌锅、超净台、培养箱、冰箱、烤箱、电子天平。三、实验材料和用品（/组） 枯草芽孢杆菌、人体口腔黏膜细胞、洋葱鳞茎表皮细胞、细菌培养基、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、接种环、解剖针、0.02%詹纳氏绿染色液（詹纳氏绿0.02 g溶于100mL生理盐水中）、0.1% 亚甲基蓝染液（亚甲基蓝0.1 g溶于100 mL蒸馏水）滴瓶3个、鸭嘴瓶、废液缸、吸水纸、消毒酒精瓶、消毒牙签、棉球若干、记号笔。四、实验方法和步骤 1. 枯草芽孢杆菌菌体染色观察：

19、在载玻片中央滴加一滴0.02詹纳氏绿染色液，用接种针从新鲜生长的枯草芽孢杆菌菌落中挑取菌体，在染液中涂展开来，使之分布均匀，染色3 min，加上盖玻片，在显微镜下由低倍镜到高倍镜再用油镜进行观察。细菌细胞被染成蓝绿色，杆状，活细菌在显微镜下可以观察到其运动情况。 2.人口腔黏膜细胞线粒体詹纳氏绿染色观察：取0.02詹纳氏绿染色液于干净的载玻片中央，用消毒牙签轻轻刮取口腔颊内壁的黏膜上皮细胞。将刮取物置于载玻片上的染液中，混匀，23min 后，盖上盖玻片。置于显微镜下观察。先用低倍镜再换高倍镜观察，在高倍镜下可见口腔黏膜细胞的细胞质中，散布着被染成蓝绿色的杆状和椭圆形的颗粒即为线粒体。观察人体口

20、腔黏膜细胞中线粒体的形态及染色情况，比较其与枯草杆菌形态及染色的异同点。3. 洋葱鳞茎表皮细胞的观察：用镊子从洋葱鳞茎内表面撕取一小块表皮，铺在加有一小滴水的载玻片上，并用解剖针轻轻地展平，然后加上盖玻片，置低倍显微镜下观察。细胞略成长方形或楔形。每个细胞内有一卵圆形的细胞核，核内有时可以看到 1 2 个核仁。在高倍镜下，调节光线至适宜强度时，可以看到细胞外围有一双层结构的细胞壁。转动细调节器，仔细观察，在细胞内能看到内含微粒的细胞质。在细胞质中，有充满着细胞液的液泡。为了更明显地区别细胞质和细胞核，可在盖玻片的一侧滴少许 0.1% 亚甲基蓝染液，从另一侧用小片吸水纸吸引，将染液引到标本上，1

21、-2 分钟后，细胞核就会染成浅蓝色。比较植物细胞和动物细胞的异同点。五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 根据你的观察结果，比较人体口腔黏膜细胞中线粒体的形态及染色情况与枯草杆菌形态及染色的异同点。3. 根据你的观察结果，比较植物细胞和动物细胞的异同点。实验三 微生物的显微直接计数法（2学时）一、实验目的和原理实验目的：1. 了解血球计数板的构造和使用方法。2. 学会用血球计数板对酵母细胞或真菌孢子进行计数。实验原理： 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。该计数方法被广泛应用于酿酒和饲料酵母等的工业化生产中。此法的优点是直观、

22、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 01mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分

23、成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数：因1mL=1cm3=1000mm3，（即0.

24、1mm3中的总菌数）为A/5×25×B。故1mL菌液中的总菌数A/5×25×10×1000×B50000 A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A，则1mL菌液中的总菌数A/5×16×10×1000×B32000 A·B（个）二、实验仪器光学显微镜、灭菌锅、超净台、培养箱、冰箱、烤箱、电子天平。三、实验材料和用品（/组） 酵母菌悬液或真菌孢子悬液、血球计数板、盖玻片、镊子、滴管、鸭嘴瓶、废液缸、吸水纸、消毒酒精瓶、棉球若干。四、实验方法和步骤 4

25、.1 稀释将酿酒酵母菌或真菌孢子悬液进行适当稀释(1000倍，称取0.05g酵母干粉加入到50ml无菌水中，充分振荡混合均匀)。4.2 镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。4.3 加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌或真菌孢子液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4.4 显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后

26、再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。4.5 清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做完实验后，完成实验报告的全部内容，将计数结果

27、记录于下表中，并计算每毫升菌液中的总菌数。下表中 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。3.根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？ 实验四 真菌的组织块分离法（2学时）一、实验目的和原理实验目的：了解真菌的组织分离法的定义和特点，掌握真菌子实体组织分离的操作方法和要点。实验原理：采用无菌操作，将某种真菌从混杂的微生物群体中分离出来进行纯培养，从而获得纯菌丝体的方法，称为菌种分离，分离所得的纯菌丝体即为原始母种。菌种分离既是菌丝纯化的过程，也是制种工作的重要环节，菌种分离的方法，依据分离材料的不同可分为孢子分离法、基内菌丝分离法和

28、组织分离法。孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子即担孢子、子囊孢子,无性孢子即厚垣孢子、节孢子、粉孢子等萌发成菌丝,来获得纯菌种的一种方法。由于孢子的数量大,变异的机会多,因此采用孢子分离法,可以有更多选择优良菌株的机会。此方法多用于菌种选育。利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。此种分离方法适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。基内菌丝分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即

29、菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。组织分离是指在子实体上切取一块组织，使其在培养基上萌发而获得纯菌丝体的方法。组织分离具有分离取材广泛，操作简便，分离成功率高的特点。大型真菌的子实体是由菌丝体扭结形成的组织化菌丝，它们均具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，组织分离法就是利用这一特点来获得生产用菌种。组织分离属于无性繁殖，有利于保持原有品系的遗传特性。本实验以大型真菌香菇或平菇的子实体为例介绍真菌组织块的分离培养方法。二、实验设备高压灭菌锅、天平、鼓风干燥箱、生化培养箱、超净工作台。三、实验材料和用品（/组）新鲜香菇子实体、无菌马铃薯葡萄糖培养基斜面3支、75消毒酒精、棉球若干、无菌解剖

30、针、解剖刀、酒精灯、记号笔。四、实验方法与步骤1.表面消毒：点燃酒精灯，首先用75%酒精消毒双手，然后用75%酒精擦拭食用菌子实体各个表面，起到消毒杀菌作用。2.组织分离：分离用具经75%酒精擦拭表面消毒，后火焰灭菌，按无菌操作要求，在火焰旁用手将菇体从菌盖纵向撕开或在适当位置将子实体剖开，用已冷凉的刀片在菌柄与菌盖的交接处或菌柄上部的菌肉处切取绿豆大小的菌肉组织（注意不要碰到菌褶），然后用无菌解剖针将此菌肉组织迅速接入斜面培养基，塞上硅胶塞。3.培养：于25 恒温培养。23天后观察，组织块上即可萌发出大量菌丝，此后每隔23天检查一次杂菌污染情况，发现污染立即处理。一般经810天菌丝可长满斜面

31、，即为原始母种。五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做完实验后，完成实验报告的全部内容。3. 为什么要切取菌柄与菌盖交接处或菌柄上部的菌肉进行组织分离？4. 操作中要注意哪些细节才能保证菌种不被杂菌污染？实验五 土壤中微生物的分离和识别（4学时）一、实验目的和原理实验目的：土壤环境中存在大量的微生物,这些微生物对土壤肥力起着极其重要的作用，研究土壤中微生物的种类及数量变化是研究土壤肥力变化规律的有效途径，而从土壤中分离识别出各种微生物则是上述研究的基础。本实验练习采用相应的选择性培养基，应用稀释法从土壤中分离出微生物，学习根据菌落形态，镜检和染色制片

32、的方法识别不同种类的微生物。实验原理：样品通过系列稀释，然后在固体培养基上用涂布、划线或以培养液稀释的方法分散细胞，经培养后获得纯种的单菌落。二、实验仪器高压灭菌锅、天平、冰箱、鼓风干燥箱、生化培养箱2台、光学显微镜、超净工作台、振荡器等。三、实验材料和用品（/组）肥沃土壤（去掉表层510厘米的土壤后，采挖下面富含有机质的土壤适量，采样后立即使用或于46冰箱保存，一周内使用）、自封袋、含有玻璃珠（1520粒）45毫升无菌水的100mL三角瓶、1mL无菌移液管7支、移液管架、含有9毫升无菌水的大试管5支、硅胶塞5个、大试管架、牛肉膏蛋白胨琼脂平板4套、马铃薯蔗糖琼脂平板4套、刮刀（玻璃涂棒）2个

33、、记号笔、载玻片、无菌水、消毒酒精瓶、棉球若干、滴管、接种环、酒精灯、美兰染色剂、鸭嘴瓶、废液缸、吸水纸。四、实验方法和步骤（一） 稀释法分离土壤中的微生物1. 编号：取含有玻璃珠和45毫升无菌水的100毫升三角瓶，编号为10-1；含有9毫升无菌水的大试管5支，依次编号为10-2，10-3，10-4，10-5，10-6；取4套已倒好细菌培养基的培养皿，其中2套在皿盖上标明“细（10-5）”，另2套标明“细（10-6）”。再取4套已倒好真菌培养基的培养皿，其中2套在皿盖上标明“真（10-5）”，另2套标明“真（10-6）”。2. 将土壤5克放入一个含玻璃珠及45毫升无菌水的100毫升三角瓶内，在

34、振荡器上充分震荡20分钟，然后静置使土粒下沉，用无菌移液管自瓶中吸取1毫升上清液转移至编号为10-2的试管中，摇匀后更换新的无菌移液管从中吸取1毫升溶液转移至编号为10-3的试管中，依此系列稀释，直至10-6。注意无菌操作。3. 先将需要试管10-5稀释液的培养皿放在一起，用无菌移液管按每皿0.1毫升，将稀释液分别接入各平皿中，之后，用无菌刮刀涂布均匀。按图4所示，在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置510min，使菌液吸附进培养基。平板涂布方法：将0.1mL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置(0.1 mL的菌液要全部滴在培养基上)。右手拿无菌刮刀平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条

35、直线轻轻地来回推动，使之分布均匀（见图4），然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。4. 将需要试管10-6稀释液的培养皿放在一起，另取无菌移液管按每皿0.1毫升，将稀释液分别接入各平皿中，之后，另取刮刀涂布均匀。图4 平板涂布操作5. 注明日期，细菌放30培养箱倒置培养，真菌放25培养箱倒置培养。一周后观察。（二） 土壤中分离到的微生物的识别 观察培养一周后的真菌培养基上和细菌培养基上的各个菌落形态，辨别其大致分类。五、作业：1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做完实验后，完成实验报告的全部内容。3. 为什么要将土壤浸出液

36、进行系列稀释后再选择适当浓度的稀释液进行平板涂布后培养？4为什么培养基接种后要倒置培养？实验六 生物培养基的制备和灭菌技术（4学时）一、实验目的和原理实验目的：1.了解生物培养基的概念，种类和用途。2.掌握生物培养基的配制方法和灭菌技术。实验原理：选用各种营养物质，经配制用于培养微生物或动植物细胞组织培养的基质称为培养基。根据培养基的主要成份、使用目的、生产工艺的要求来配制培养基。微生物培养基有筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌和发酵生产方面等用途。培养基的种类很多。根据营养物质的来源，可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基等；根据培养基外观的物理状态可分为液体培养基和固体培养基；根据培养基的主

37、要成分或使用目的不同，可分为基础培养基、完全培养基、鉴别培养基和选择培养基等；根据生产工艺的要求又可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基等。天然培养基适合于各类异养微生物生长，而一般自养型微生物都不能生长。合成培养基适用于某些定量工作的研究，这样可以减少不能控制的因素，但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上还不能生长。多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品，就叫半合成培养基，其特点是使用含有丰富营养的天然物质再补充适量的无机盐十分方便，能充分满足微生物的营养需要，大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此在

38、微生物发酵生产上和试验研究中广泛使用。微生物发酵中大多采用液体培养基作为培养种子和发酵的培养基，根据微生物对氧的要求情况，分别进行静止培养或通风搅拌培养。在菌种筛选和育种工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养。微生物在液体培养基中生长的情况有时也用作鉴定菌种的参考。固体培养基一般是液体培养基中加入凝固剂而配成，最常见的凝固剂就是琼脂。固体培养基在菌种的分离、保藏、菌落特征的观察、活菌计数和菌种鉴定方面是不可缺少的。基础培养基、完全培养基、鉴别培养基和选择培养基常用于分离、鉴定和选育菌种，而孢子培养基、种子培养基和发酵培养基则应用于微生物工艺大规模生产中的种子培养和发酵生产。二、实验仪器电磁炉、灭

39、菌锅、干燥箱、培养箱、超净台、感量0.01g电子天平。 三、实验材料和用品（/组）马铃薯、蔗糖、琼脂粉、烧杯（200mL )、三角漏斗（9cm）、止水夹、铁架台、试管(15mm×150mm)4支、 硅胶塞4个、培养皿（9cm ) 4套、瓷量杯（500 mL ）、三角瓶（150 mL）1个、封口膜1个、酒精灯、记号笔、试管架、消毒酒精瓶、棉球若干。四、实验方法和步骤1. 马铃薯培养基将新鲜无病的马铃薯块茎去皮，切成0.5 1.0cm3的小块，然后称取20g于500 mL 搪瓷量杯中加水100 mL，煮沸20分钟 ，然后用4 层纱布过滤。取滤液，加蔗糖2g,琼脂2g, 补足水分至100

40、mL，加热溶解，其中20mL趁热分装入试管中（每支试管约45 mL），加上硅胶塞，并用报纸包扎，剩余80 mL装入100 mL三角瓶，封好封口膜，并用报纸包扎，经121 灭菌20min，取出后，试管摆斜面冷却备用。三角瓶内的培养基冷却至5060 ，在无菌操作条件下倒入已经灭菌的4套培养皿中，厚度23 mm（每皿约20 mL ），冷却后倒置于37 培养箱中培养3d 。无杂菌污染即可作接种用。图3-1 培养基分装装置 图3-2 摆斜面方法 图3-3 培养基倒平板方法五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做完实验后，完成实验报告的全部内容。3. 天然培养基、

41、合成培养基和半合成培养基各自有何特点，它们在用途上有何差异？4. 如何正确选择培养基配方。实验七 总糖的测定（4学时）一、实验目的和原理 实验目的：了解糖的分析测定对于科学研究和指导生产实践的重要意义；了解糖的多种测定方法及如何选择适宜的测定方法；了解和掌握DNS法测定还原糖和总糖的原理和方法。实验原理：糖为广泛分布于生物界的有机化合物。它是生物维持生命活动的主要能量来源，也是有机体重要的组成成分。糖的复合物还参与细胞识别、细胞间物质运输和免疫功能的调节。在植物中糖含量可以高达干重的80。植物中糖的种类和含量的分析对于选种及控制培育条件有着重要的意义。在微生物发酵生产中，常以淀粉、葡萄糖等作为

42、微生物生长的碳源和能源，为了提高产量和质量，必须控制和测定培养基中糖的含量及其变化。在农产品加工业中常以糖作为主要原料和辅助材料，糖是大多数食品的主要成分之一。在农、畜产品评价利用中，也无一不与糖密切相关。因此，糖的分析测定对于科学研究和指导生产实践都十分重要。糖类包括多糖、寡糖和单糖。其中单糖和某些寡糖具有游离醛基或酮基，称为还原糖；多糖和蔗糖等则为非还原糖。糖的测定方法很多，测定单糖和低聚糖常用的方法有物理法、化学法、色谱法和酶法等。物理法包括相对密度法、折光法和旋光法。化学法是应用最为广泛的常规分析方法，主要有利用糖的游离醛基或酮基的还原性进行测定的斐林氏滴定法、3 , 5 二硝基水杨酸

43、法、蒽酮-硫酸法、地衣酚-硫酸法和地衣酚法等。色谱法有纸色谱法、薄层层析法、柱色谱法、亲和色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和离子色谱法等。酶法测定糖类，如用葡萄糖氧化酶测定葡萄糖，用半乳糖脱氢酶测定半乳糖、乳糖等。对于多糖，可用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等直接定量测定；淀粉的测定常使之水解为单糖，然后测定所生成的单糖的含量。而纤维素和果胶的测定则多采用重量法。在实际工作中要根据需要和可能选择适当的方法。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有游离醛基或酮基的糖类，例如单糖和某些寡糖（如麦芽糖、乳糖）；多糖和蔗糖等则为非还原糖。利用单糖、寡糖与多糖的溶解度不同可把它们分开，并且可以用

44、酸水解法使没有还原性的寡糖和多糖彻底水解成具有还原性的单糖，再进行测定，从而可以分别测得样品中还原糖和总糖的含量。本实验以测定淀粉中总糖含量为例。总糖的测定方法多种，本实验采用经改进的3，5 二硝基水杨酸比色法。淀粉经酸解后转化成还原糖，在NaOH 和丙三醇存在下，3 , 5 -二硝基水杨酸（DNS ）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm 波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 二、实验设备电子天平、可见光分光光度计、水浴锅、电磁炉。三、实验材料和用品（/组）3，5-二硝基

45、水杨酸（DNS ）试剂：称取6.5gDNS 溶于少量蒸馏水中，移入1 000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325mL 再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至1O00mL。每组各装100 mL DNS试剂于100mL试剂瓶中。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后以蒸馏水定容至100mL ，即含葡萄糖为2.Omg/ mL。每组各装10 mL葡萄糖标准溶液于15mL具塞试管中。6mol/L HCl溶液：取250mL浓盐酸（35%38%）用蒸馏水稀释到500mL，每组各装20 mL HCl溶液于100mL试剂瓶中。碘-碘化钾溶液：取5g碘，10g碘

46、化钾溶于100mL蒸馏水中，分装于棕色滴瓶中。0.1%酚酞指示剂：0.1g酚酞，加乙醇100 mL使之溶解。分装于滴瓶中。10%氢氧化钠溶液：100g氢氧化钠，定容于1000mL蒸馏水中，分装于滴瓶中。1mL移液管2支、2 mL移液管、10mL移液管、移液管架、25 mL 具塞试管10支、试管架、可溶性淀粉、100mL烧杯1个、50 mL烧杯、0.1%酚酞指示剂、滴瓶、玻璃比色皿4个、250mL容量瓶、滴管、玻璃棒、100mL锥形瓶、白瓷板、鸭嘴瓶、废液缸、吸水纸、记号笔。四、实验方法和步骤1. 葡萄糖标准曲线制作取5 支25 mL具塞试管，按表7-1 加入2.0mg/mL 葡萄糖标准液和蒸馏

47、水。表7-1管号葡萄糖标准液（/mL）蒸馏水（/mL）葡萄糖含量（/mg）00.01.00.010.20.80.420.40.60.830.60.41.240.80.21.651.00.02.0在上述试管中分别加入DNS 试剂2.0mL，于沸水浴中准确加热5 min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540 nm 波长处测定光吸收值。以0号管为空白调零点。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品总糖的水解及提取：准确称取1g淀粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h取出12滴置

48、于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色后，用容量瓶定容至250mL，即总糖提取液总体积为250mL。3. 样品中总糖含量的测定 取4支25 mL具塞试管，分别按表7-2 加入试剂： 表7-2项目空白总糖0123样品溶液/mL00.50.50.53，5-二硝基水杨酸试剂/mL2.02.02.02.0加完试剂后，于沸水浴中准确加热5 min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各样品管中加入蒸馏水9.5mL ，空白管中加入蒸馏水10mL，摇匀，在540 nm 波长处测定光吸收值。测定

49、后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。 4. 结果处理 按下式计算出淀粉中总糖的百分含量：总糖（以葡萄糖计) =(C×V)/(m×1000) ×100式中：C 总糖提取液的浓度，mg / mL； V 总糖提取液的总体积，mL； m 样品重量，g； 1000 mg 换算成g 的系数五、作业1. 写好预习报告，包括实验目的与原理、实验设备、实验材料与用品。2. 做完实验后，完成实验报告的全部内容。3. 在沸水浴加热显色操作时，为什么要严格控制加热时间？实验八 淀粉酶活性的测定（4学时）一、实验目的和原理实验目的：植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。

50、淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。通过本实验掌握淀粉酶的特性及其提取和测定方法。实验原理：植物中有淀粉酶和淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化，淀粉酶存在于休眠的种子中，而淀粉酶是在种子萌发过程中形成的。淀粉酶和淀粉酶，各有其一定的特性，如淀粉酶不耐热，在温度70以上易钝化，而淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。也可测定淀粉酶和淀粉酶的活性，即为淀粉酶的总活性。本实验即测定发芽小麦种子中的淀粉酶总活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5二

51、硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3氨基5硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。二、实验设备 天平、离心机、水浴锅、分光光度计、电磁炉、培养箱三、实验材料和用品（/组）1淀粉：称取1.0g淀粉溶于100mL蒸馏水煮沸。（临用时配制）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01 g，溶解后稀释定容至l000 mL；B液：称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后稀释定容至1000 mL。取A液275 mL与B液725 mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。每组各装100

52、 mL于100mL试剂瓶中。3, 5二硝基水杨酸溶液（DNS试剂）：称取6.5gDNS 溶于少量蒸馏水中，移入1000mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325mL 再加入45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至1O00mL。每组各装100mL DNS试剂于100mL试剂瓶中。麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100 g溶于少量蒸馏水中，仔细移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。每组各装10mL麦芽糖标准溶液于15mL具塞试管中。 0.4 mol/L氢氧化钠溶液，每组各装20mL于100mL试剂瓶中。萌发的小麦（芽长1 cm左右）、手术剪、研钵、石英砂、药品匙、50mL烧杯、10mL移液

53、管1支、lmL移液管2支、2mL移液管4支、5mL移液管1支、移液管架、玻璃棒、离心管、 50mL容量瓶、滴管、25mL具塞刻度试管15支、试管架、记号笔、比色皿、鸭嘴瓶、废液缸、吸水纸。四、实验方法和步骤1. 麦芽糖标准曲线制作：取7支干净的25 mL具塞刻度试管，编号， 按表8-2 加入1mg/mL 麦芽糖标准液和蒸馏水。表8-2管号麦芽糖标准液（/mL）蒸馏水（/mL）麦芽糖含量（/mg）102.0020.21.80.230.61.40.641.01.01.051.40.61.461.80.21.872.002.0在上述试管中分别加入DNS 试剂2.0mL，具塞，于沸水浴中准确加热5 m

54、in 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水15mL，摇匀，在520 nm 波长处测定光吸收值。以1号为空白调零点。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。2. 酶液的提取  称取去根萌发（25泡发2天）的小麦种子0.5 g，置研钵中加1 mL蒸馏水和2g石英砂，研磨成匀浆后转入离心管中，用3mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次使其充分提取。然后在3500r/min转速下离心10 min，将上清液倒入50mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶粗酶液。 3淀粉酶和淀粉酶的酶促反应取4

55、支25mL具塞刻度试管，编号，按表8-1加入各液，注意移液管的分别使用，以避免酶遇强碱失活。表8-1编号1（对照）2（对照）3（反应）4（反应）粗酶液（mL）1111pH5.6缓冲液（mL）11110.4mol/L NaOH（mL）4400预热1%淀粉（mL）2222将以上各管混匀后，置40水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号试管中加入4mL 0.4mol/L NaOH终止酶活性。 4. 样品中麦芽糖含量测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2 mL，分别加入25mL具塞刻度试管中，加入2mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，加蒸馏水15mL，摇匀后以标准溶液中的1号管作为空白调零点，在520 nm 波长处测定光吸收值，从麦芽糖标准曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。5.结果计算（A-A）&