酵母单杂交试验步骤总结

1、1 pBait-AbAi载体的构建(酵母报道子的构建)注：酵母报道子(pBait-AbAi )包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝， 且插入到pAbAi载体AbAir报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含 目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长 度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。(1) 设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与 pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端(建议合成一个目的序列的突变序列 作为对照，以排除可能的假阳性)。(2) 用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100mol/L。(3)

2、 将正向链和反向链按照1:1的比例混合(退火后的双链寡核苷酸最大浓度 为 50mol/L)。(4) 95 C保温30 s，去除二级结构。(5) 72 C保温 2 min，37 C保温 2 min，25 C 保温 2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。(6) 冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C冰箱备用。(7) 酶切1 JL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。(8)将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 5ol/L(9)在连接反应管中加入如下成分:pAbAi 载体(50 ng/ JL)ann ealed

3、 oligo nu cleotide10X T4 DNA ligase bufferBSA( 10 mg/mL)Nuclease-free H OT4 DNA ligase (400 U/ JL)1.0JL(0.5 Jmol/L )1.0JL1.5JL0.5JL10.5JL0.5JL总体积15JL注：如果有必要，可用1 JL nuclease-free H 2O代替寡核苷酸作为阴性 对照。(10)将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成 Bait-Reporter 酵母菌株(图)Linearize pBait

4、-AbAi and integrate into the ura3-52 locus of YlH GoldAbAUMJ图3 Bait-Reporter 酵母菌株生成原理示意图(1) 用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 JL pBait-AbAi ，pMutant-AbAi，p53-AbAi 质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。(2) 按 Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤用 1 Jl 酶切后的 质粒转化Y1HGold酵母。(3) 稀释每个转化体系至1/10、1/100、1/1000,分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura

5、琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1进行PCF检测阳性克隆，用 Y1HGold的单克隆做阴性对照。(4) 在 PCRt中力卩 25 T PCR-grade H 2Q(5) 用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头 伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCF反应的进行。如 果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。(6) 向每个管中加入25川Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离心。每个PCR管中现已含有

6、如下反应物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25川2550H20/yeast总体积(7)按下述程序进行PCF反应;95C1 min98P10 s)55 P 30 s 30 cycles68乜2 minJ(8) 取5PCR产物，用1%勺琼脂糖凝胶电泳分析。注：引物与AbA基因以及URA3F游的YIHGold基因组结合，扩增片段长约1.4 kb。图4 PCR检测pBait-AbAi的插入情况正确的PCRi测结果应是:阳性对照：1.4 kb阴性对照：无条带诱饵菌株：1.35 kb+in sert size(9) 分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和 p53-AbAi对

7、照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。30 C孵育3 d后，将平板置于4 C保存，即为新构建 的 Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi对照菌株。(10) 经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集 菌体，用1 mL预冷培养基(100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合)重悬菌体，速冻后与-70 C保存。3检测诱饵菌株AbA基因的表达在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵 菌株报告基因的本底表达水平也不相同。例如：p53-AbAi对照的最低 aureobasidin A 抑制浓度为 100 ng/ml。

8、注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与目的序列结合或者结合能力非常弱。因此在进行文库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbA基因的表达情况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株 报告基因本底表达所需的AbA浓度。(1) 分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002(大约2000个细胞/100屮)。(2) 在下述培养基上分别涂布100 T重悬后的菌液，30 C培养2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA ( 100 ng/mL)SD/-Ura with AbA ( 150 ng/mL)SD/-Ura with

9、AbA ( 200 ng/mL)预期结果如下所示：表1 AbA基因预期本底表达结果AbA/ (n g/mL)Y1HGoldp53-AbAi克隆数Y1HGoldpBait-AbAi克隆数0约 2000约 20001000Bait depe ndent1500Bait depe ndent2000Bait depe ndent(3) 在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑 制浓度稍高的AbA浓度(高约50-100 ng/mL)，以彻底抑制诱饵菌株的生 长。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高 AbA浓度至500-1000 ng/mL。然而，在

10、不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制AbA基因的表达，那么很可能存在能够识别并与目的序列结合的 内源调控因子，因而该目的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总RNA进行反转录合成cDNA合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec 相同的酶切位点。（1）cDNA第一链的合成准备高质量的poly A 和/或总RNA用human placenta poly A+RNA 作为阳性 对照。注：RNA勺质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA在微量离心管中加入如下反应物：RNA 模板(0.025-1.0 旳 poly A和

11、/ 或 0.10-2.0 旳 总 RNA 1-2CDS III (oligo-dT ) or CDSII/6(random)引物1.0Deioni zedHO （使总体积达到4.0 T ）1-2总体积4.0Jl在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 Jl （1 Jg） control polyA+RNA 72 C孵育2 min。 冰上放置2 min，轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。 每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5 x first-strand buffer2.0DTT( 100 mmol/L)1.0dNTP mixture ( 10 mmol/L)1.0SMART M-

12、MLV RT1.0总体积5.0注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的 RNA引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。 如果用的是CDSHI/6 随机引物，25-30 C保温10 min。如果用的是CDSIII 引物，省略此步，进行步骤。 42 C保温10 min。 加入1 T SMART III oligo，充分混合，42 C保温1 h 75 C保温10 min终止第一链的合成。降至室温，加入1 Jl RNase H （2 U）11 37 C保温 20 min。12 cDNA第一链合成产物应于-20 C保存，可用3个月（2）long dista

13、nee PCR （ LD-PCR 合成 cDNA第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的热 循环数。使用的热循环数越少，非特异性 PCR产物越少。表2 RNA量与最佳热循环数总RNA/gPoly A+RNA/g循环数1.0-2.00.5-1.015-200.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反应混合物中加入如下物质（每个样品做 2个100出体系，对照做1个100屮体系）：First-stra nd cDNA( from protocol A)2 Dei on ized H 2O7010

14、X adva ntage 2 PCR buffer10出50 x dNTP mix25'RAC呂 1 物23'RAC呂 1 物2Melt ing soluti on10出50 x adva ntage 2 polymerase mix2出总体积100I按照以下程序进行PCR反应:1个循环95C 30 sX个循环95C 10 s68C 6 min1个循环68C 5 min取7 T PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使用 1 kb DNA ladder（2）使用 CHROMA SPIN+TE-40柱纯化 ds cDNA为每一个要纯化的 cDNA样品准备一个 CHROMA

15、SPIN+TE-40柱。将纯化柱翻转几次，充分悬浮 gel matrix 。移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中将柱放入离心机，700 g离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的 内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段cDNA700 g离心5 min，纯化的cDNA攵集到管中。将两个纯化的cDNA样品合并到一管，测量体积。加入1/10体积3 mol/L醋酸钠(pH5.3),混匀。加入2.5倍体积无水乙醇。-20 C冰冻1 h。(11) 室温，14000 r/min 离心 20

16、min。(12) 小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。(13) 14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。(14) 沉淀于空气中干燥10 min。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。(15)用20 Jl灭菌去离子水溶解沉淀，此 cDNA可用来进行同源重组构建文库。纯 化后的cDNA用 1%勺琼脂糖电泳检测。5构建并筛选酵母单杂交文库（cDNA融合表达文库的构建及筛选）（1） 构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测 Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。（2） 按SMART technology步骤合成ds

17、cDNA,其浓度为2-5 弋/20 儿。（3） 用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中加入 如下物质： cDNA文库转化 Y1HGoldBait/AbAi菌株20 屮 SMART-amplified ds cDNA （ 2-5 弋）6 屮 pGADT7-Rec， （ Sma I-linearized）（ 3 .二g） Y1HGold 53/AbAi的转化5 屮 p53 fragment（ 125 Jg）2 T pGADT7-Rec,（ SmaI-linearized ）（ 1g）将转化体系分别稀释至 1/10、1/100、1/1000、1/10

18、000后，各取100川 涂100 mm平板。文库转化涂 SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照 p53转化涂SD/-Leu和 SD/-Leu/AbA200 平板。（4）将剩余的所有文库转化混合物（约 15 ml ）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平 板上，每板涂150 Jl。（5）倒置培养3-5 d。（6） 3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数目来计算筛选的克 隆数。注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到目的产物的可 能性。筛选的克隆数=cfu/ml on SD/-Leu x dilutionfactor xresuspension

19、 volume（15ml）例如：resuspension volume=15 mlPlati ng volume=100 Jl250 colo nies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe nu mber of clones scree ned=250 cfu/0.1 mlX 100 X 15 ml=3.75millio n(7)预期结果阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数， 其结果 应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的

20、克隆数远远少于1百万，阳性克隆数目取 决于诱饵序列。6阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离(1) 阳性克隆重新划线培养，进行表型确认 将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。 2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。(2) 酵母克隆PCF消除重复克隆 用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2(Cat.No.630497 )进行 PCR 对插入到pGADT7载体中的cDNA片段进行扩增。PCR管中加入以下反应物：Matchmaker In sert Check PCR Mix25JlH 20/Yeast25屮总体积50Jl 按下述

21、程序进行PCR反应：94 C 1 min98 C 10s68 C 3 min产物不是单一的条带很正常，这 PCF产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用 Alu I或Hae III 或者其它常用的限制性内切酶消化 PCR产物，产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳 分析。 如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。 为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。（3）阳性cDNA质粒的分离获取 酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着 阳性克隆里不只含有能激活 AbA报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表 达相互作用蛋白的cDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转 化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳 性克隆捕获质粒的几率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3 次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。 从酵母中获取阳性cDNA质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit（Cat.No.630467 ）从酵母中获取阳性质粒。 转化E coli并分离阳性cDNA质粒用常用