生物文献翻译《人类钙黏着蛋白11是一种促细胞凋亡的肿瘤抑制因子癌症中通过Wntb蛋白信号传递沉默调控细胞

1、人类钙黏着蛋白11是一种促细胞凋亡的肿瘤抑制因子，在共同的癌症中通过Wnt/b-连接蛋白信号传递和沉默调控细胞stemness16q21-Q22的遗传变异，6-钙黏着蛋白集群的位点，是频繁的涉及多种癌症，暗示这之中存在关键的肿瘤抑制基因（TSGs）。采用1MB阵列比较基因组合杂交（aCGH），我们精确地定位了一个小的半合子删除位点(B1MB)在16q21-22.1，其中包含一个单一的钙黏着蛋白-11基因（CDH11，OB-cadherin）。CDH11是广泛表达在人类正常成年和胎儿组织中，同时它的沉默和启动子CpG甲基化经常发现在肿瘤细胞株中，但是不会再正常的上皮细胞中永生。异常甲基化也经常发

2、生在多种肿瘤中。CDH11沉默可能被颠倒由于药理化或者基因去甲基化，表明一种遗传学的机制。CDH11的异位表达强烈地抑制了肿瘤基因和诱导肿瘤细胞凋亡。此外，CDH11被发现是抑制Wnt/b-钙黏着蛋白和AKT/Rho A信号，以及肌动蛋白应力纤维的形成，从而进一步抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。CDH11也抑制epithelialto间质转型及下调干细胞标记。因此，我们的工作，确定了CDH11作为一种功能性肿瘤抑制因子和一个WNt/b-钙黏着蛋白和AKT/Rho A信号的重要拮抗剂，在共同的癌症中频繁的遗传性失活。背景介绍：使用微卫星标记的各种基因分析已经证实了在多种肿瘤中16q的杂合性频繁流失，包

3、括鼻咽癌，肝癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌和胃癌等。一个决定性的缺失区域已被定位在16q22.1-16q24.3上，暗示候选癌症的抑制基因的出现（TSG）。几个候选的TSGs已经被确定在这一区域了，包括WWOX，CBFA2T3，ATBF1，CMTM3和E-钙黏着蛋白。钙粘素是构成细胞与细胞之间分子链接的重要组成，通过Ca2p依赖的同种相互作用介导实现细胞间粘附的。通过形成二聚体，钙粘素能够聚集，通过一个拉链机制而实现的，而他们的细胞内区域对于肌动蛋白细胞骨架是一个固定区域通过a-钙粘素和b-钙粘素。这些相互作用在维护关键角色组织架构和细胞极性以及限制在肿瘤细胞中运动和增值中起到重要作用，从而导致细

4、胞抑制。六种传统的钙黏着蛋白家族成员，包括CDH1，CDH3，CDH5，CDH8，CDH11和CDH13是位于16q22.1-16q24.3上，作为一个称为6-钙黏着蛋白集群。有些钙粘素已经被确定为功能性的肿瘤抑制物，例如CDH1和CDH13/H-钙粘素，参与细胞增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。TSGs遗传学改变，包括启动子CpG甲基化和组蛋白修饰，经常参与肿瘤的发生和发展。值得注意的是，在肿瘤CDH1和CDH13遗传学上的沉默已经在多种上皮性肿瘤和造血系统恶性肿瘤中有所报道，表明启动子CpG甲基化介导的沉默是一个重要的监管机制在肿瘤发生破坏的钙黏着蛋白家族成员中。之前我们已经进行了1MB阵列比

5、较基因组杂交的肿瘤细胞株（aCGH）的分析，并确定为唯一的基因CDH11位于16q22.1检测在1MB半合子缺失。因此，我们推测，在肿瘤发生中有牵连，CDH11可能是一个重要的抑癌因子。目前，我们的遗传学上和功能上的研究表明，经常有CDH11是灭火多个癌基因的启动子甲基化和作为一种肿瘤抑制基因而起作用，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞运动侵袭，以及细胞的干性，并通过Wnt/b-catenin和AKT/Rho信号。实验结果：1、 在16q21-22.1上CDH11的识别作为一个候选TSG2、 在常见的癌症中启动子CpG甲基化使CDH11频繁沉默3、 在多种原发性癌症中去甲基化恢复的CDH11的表达和C

6、DH11频繁的甲基化4、 CDH11抑制肿瘤细胞的集落形成和诱导细胞凋亡5、 CDH11抑制Wnt/b-catenin信号通路6、 CDH11调节激动蛋白细胞骨架组织，细胞迁移和入侵7、 CDH11管制了上皮-间质转化和干性实验讨论：在这项研究中，我们发现，虽然CDH11是广泛表达在人类正常成年人和胎儿组织中，它通常是在多种常见的癌症细胞中出现甲基化沉默，但很少在正常组织中沉默。药物或者基因甲基化导致了CDH11表达的恢复。我们还发现，CDH11作为促凋亡的肿瘤抑制基因，通过拮抗Wnt/b-catenin和AKT/Rho信号通路和破坏应力纤维的形成，进一步抑制肿瘤细胞的EMT和干性、迁移侵袭。

7、我们的研究是第一次研究，展示了CDH11的功能机制，并大力支持了CDH11是抑癌因子的概念。CDH11，一个二型古典钙粘素，最初确定在成骨细胞中，后来发现在一定具有侵入功能的肿瘤细胞中过度表达。此前有研究表明，CDH11是一些肿瘤候补致癌基因如前列腺癌、乳腺癌和口腔癌等。最近，越来越多的证据表明，CDH11可能是抑癌因子的候选者，在16q位点的杂合性区域频繁的缺失，在多种癌症中。例如，CDH11遗传性缺失已发现超过一半的视网膜母细胞瘤，作为一个在视网膜母细胞瘤的潜在霍芬海姆牵连CDH11。使用16q专一性的aCGH，在乳腺癌的发生中CDH11被确定为肿瘤候选抑制因子。结合表观基因组学分析，恶性

8、嗜咯细胞瘤也证实了CDH11作为候选抑癌因子的潜力。CDH11的过表达抑制在体内骨肉瘤肺转移中发现。这些结果均符合我们所支持认为的CDH11是一种烈性肿瘤抑制因子。TSGs更经常通过遗传学灭活机制，如启动子CpG甲基化，或者组合遗传和表观遗传失活，比等位基因遗传灭活。三种钙黏着蛋白家族成员作为TSGs基因灭活和或者表观遗传学在多种肿瘤细胞中和包括在肿瘤洗吧的侵润和转移中，这些之前都是有报道的。我们这里还发现，CDH11是第四种钙黏着蛋白在多种肿瘤细胞霍芬海姆成员运作中起作用，但是由于CpG甲基化在多种癌症中发生沉默。我们还发现，没有检测到甲基化，在一些癌细胞株中CDH11表达减少，这表明组蛋白

9、修饰可能是一种替代机制在肿瘤发生下调中。在小鼠视网膜母细胞瘤模型中通过促进肿瘤细胞死亡中，CDH11首次发现作为一个候选肿瘤抑制因子，但是它是如何在人类肿瘤中发生功能的至今没有很好的解决。CDH11是唯一在钙黏着蛋白中作为两种选择性剪接形式同时表达的：完整形式和一个羧基截断变种而导致同种细胞与细胞的粘附能力丧失。因此，作为一个显性负产品也是一种分泌形式。我们还发现，当全长CDH11是被引入到肿瘤细胞中的，它的完整形式是主要的异构体，虽然一个微小的截断变异量也发现了，在与以往的研究中。在CDH11表达的癌症细胞中CDH11的亚细胞定位展示了钙黏着蛋白家族成员清晰的膜化功能。此外，我们发现，CDH

10、11完整形式显示了抑制转染细胞的恶性增殖，迁移/入侵和促进肿瘤细胞的凋亡特性，作为一个功能的肿瘤抑制基因与以前发现的相似，完整的CDH11抑制了乳腺癌细胞的侵袭。虽然入侵的促进作用已有报道，但是需要更多的研究来界定CDH11截断变异在不同肿瘤发生中所扮演的角色。与钙粘蛋白相关的B-catenin联合体，其核转录作用有一个独特的作用。作为一个功能性粘合交界分子，CDH11介导钙依赖性的细胞粘附，通过a-catenin、b-catenin和p120ctn与细胞膜，参与Wnt/b-catenin信号通路调节。在我们的研究中，发现核外电子封存在b-catenin，并降低了b-catenin/TCF介导

11、的增殖和转录活性，从而破坏Wnt/b-catenin信号，以及一个以rho,AKT和JNK交叉的CDH11信号。按照这个机制，我们观察到破坏激动蛋白聚合后CDH11表达和逆转EMT表型。EMT促进细胞的自我更新，从而有利于入侵和转移的级联反应。Cadherin家族成员的角色在细胞中所起的作用是复杂的，取决于协调监管的钙粘素。E-cadherin蛋白已被确定为胚胎肝细胞多功能性的关键分子。在我们的研究中，CDH11的几个干细胞标记物下调表明在调节肿瘤细胞的干性的CDH11的潜力，这可能是由于E-cadherin的增加和抑制了肿瘤的作用。总之，我们的研究确定了CDH11的抑癌功能和Wnt/b-ca

12、tenin和AKT/Rho A信号的重要调节。我们的研究进一步扩展了当前对钙粘素家族在肿瘤形成中所起作用的理解。材料和方法：细胞系和组织样本使用了一系列的肿瘤细胞株。永生，不改变正常的上皮细胞株（HET-1A,NP69，NE083，NE1，NE3，CCD841-CON,HMEC和HMEpC）被用作正常对照。HCT116细胞株与DNMTs遗传KO：HCT116 DNMT1/(1KO),HCT116 DNMT3B/(3BKO)和HCT116 DNMT1/DNMT3B/(DKO)细胞，也可使用。细胞株无论是从美国典型培养物或者从合作者中忽的都按要求保藏。细胞株，用10nmol/L的5-氮杂-20-脱

13、氧胞苷 保藏3天或进一步处理与100nmol/L的典古菌素A额外B16 h为先前所诉。正常成人和胎儿组织的RNA和蛋白质样品均购于商业。正常的鼻咽癌和乳腺癌组织DNA样本，来自亚洲的中国NPC，匹配香港中文食管癌和匹配手术边缘正常组织和其他癌，如先前描述。抗体使用的抗体是裂解caspase-7，裂解caspase-9，裂解caspase-3，裂解poly，polymerase，phospho-b-Caenin,phosphor-GSK-3b，phospho-AKT (Ser473), phospho-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185), RhoA (2117) 和 E-cadher

14、in。Flag M2,Vimentin 和active b-catenin。Total b-catenin ,antimouse lg G-HRP, anti-rabbit lg G-HRPCCND1,c-myc,phosphor-RhoAMMP7Monoclonal CDH11 antibodyAtubulin半定量RT-PCR如前所述。GAPDH的扩增作为对照。通过多重PCR CDH11的缺失分析CDH11纯合性缺失研究采用多重PCR，如前所述的基因组DNA PCR。亚硫酸盐处理和启动子甲基化分析重亚硫酸盐修饰的DNA，MSP和BGS进行如前所述。CDH11表达载体构建和稳定细胞株的增殖C

15、DH11的全长cDNA PCR克隆来自人类气管RNA引物和序列验证。pcDNA3.1(þ)-Flag-CDH11质粒构建如前所述。这个表达载体构造转入HONE1和KYSE150细胞中，使用脂质体2000细胞培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并选定在400mg/ml的G418中20-30天，以建立稳定的细胞集群。集落形成实验如先前进行了克隆形成实验。简言之，细胞过夜培养在12孔板上合转染空载体或CDH11表达质粒用脂质体2000。48小时后，一式三份，转染人依赖的完全培养基中培养10-15天。用龙胆紫染色，甲醛固定，观察可见菌落。计算。TUNEL法检测盖玻片上培养的细胞

16、，用4%多聚甲醛固定在磷酸缓冲生理盐水中15分钟，在室温0.1%的TritnX-100在温度和透磷酸盐缓冲生理盐水冰2分钟。TUNEL染色是使用在细胞凋亡原位检测试剂盒，根据制造商的指示操作。Western blot细胞溶解物制备孵化裂解细胞颗粒制备缓冲液，在冰上30分钟，离心14000/15分钟 4度。对于免疫印迹，膜孵育和初级抗体在室温1小时，其次是培养二级抗体4度过夜。免疫反应是可视化的western blot 鲁米诺试剂，根据制造商操作。双荧光素酶检测TCF转录活性和它的靶基因的启动子由荧光素酶报告分析获得。TCF反应的荧光素酶构造。细胞瞬时转染，一式三份与荧光素酶和phRL-TK。转染48小时之后，荧光素酶活跃，采用双荧光素酶测定试剂盒。相对荧光素酶的活动确定和规范化使用Renilla reniformis 荧光素酶作为一个内控。间接免疫荧光法盖玻片上生长的细胞间接免疫荧光染色，如前所述。简单的说，CDH11初级抗体与细胞联合培养，B-连环素，E-cadherin，或波形蛋白，然后孵育或FITC标记的第二抗体对小鼠或兔lgG。为了分析肌动蛋白的影响CDH11应力纤维的形成，细胞饥饿24小时前在含